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Una nueva proteína híbrida compuesta de superóxido
Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 6892 (2023) Citar este artículo
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Se preparó una nueva proteína híbrida compuesta por un complejo de Cu (II) activo con superóxido dismutasa (CuST) y lisozima (CuST@lysozyme). Los resultados de los análisis espectroscópicos y electroquímicos confirmaron que CuST se une a la lisozima. Determinamos la estructura cristalina de CuST @ lisozima con una resolución de 0,92 Å, lo que reveló que el grupo imidazol His15 de lisozima se une al centro Cu (II) de CuST en la posición ecuatorial. Además, CuST se fijó en su posición mediante la débil coordinación axial del grupo hidroxilo Thr89 y el enlace de hidrógeno entre el grupo guanidinio del residuo Arg14 y el grupo hidroxilo de CuST. Además, la combinación de CuST con lisozima no disminuyó la actividad superóxido dismutasa de CuST. Con base en estudios espectrales, electroquímicos, estructurales y cálculos químicos cuánticos, se propone un mecanismo de desproporción de O2 catalizado por CuST@lisozima.
Los organismos aeróbicos producen la energía necesaria para sustentar sus vidas a través de la respiración aeróbica. Las especies reactivas de oxígeno (ROS), como los radicales hidroxilo (·OH), el oxígeno singlete (1O2), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el superóxido (O2–) son los subproductos inevitables de este proceso. Estas ROS causan graves daños oxidativos a biomoléculas como lípidos, carbohidratos, hormonas, proteínas y ácidos nucleicos. Entre estas ROS, el O2– es producido por sistemas de transporte de electrones, procesos fagocíticos, oxidación enzimática y proteínas transportadoras de oxígeno, como la hemoglobina y la mioglobina1. En condiciones protónicas, el O2– reacciona con los protones (H+) para producir otras ROS, como ·OH y H2O22. Por tanto, la eliminación de O2– es una prioridad para los organismos aeróbicos. Para eliminar el O2 y evitar el daño oxidativo inducido por el O2, los organismos aeróbicos poseen metaloenzimas conocidas como superóxido dismutasas (SOD). Las SOD catalizan la desproporción de O2– a H2O2 y O2, como se muestra en la reacción (1):
Dado que las SOD desempeñan un papel crucial en la protección de las biomoléculas del daño oxidativo, la esperanza de vida de los organismos depende de una actividad eficiente de la SOD. Los organismos con mayores actividades de SOD tienen tasas de mortalidad más bajas y viceversa3. Los iones metálicos se encuentran en los centros activos de las SOD, que catalizan la desproporción de O2– para producir H2O2 y O2 mediante las reacciones (2) y (3), respectivamente:
Según los iones metálicos presentes en los centros activos, las SOD se clasifican en cuatro categorías; Las SOD que contienen Ni, Fe, Mn, Cu y Zn se conocen como NiSOD4,5,6,7,8, FeSOD9,10,11,12,13, MnSOD14,15,16,17,18,19 y CuZnSOD20. 21,22, respectivamente. En este estudio, nos centramos en el CuZnSOD más frecuente, que contiene iones Cu(II) y Zn(II) en su centro activo. Mientras que el ion Zn(II) fija la estructura de coordinación secundaria alrededor del centro activo23, el ion Cu(II) cataliza la reacción de desproporción del O2–, como se muestra en las reacciones (4) y (5) a continuación:
Para utilizar CuZnSOD nativo como agente de eliminación de O2, se deben resolver problemas como su alto costo e inestabilidad24. En este contexto, se han descrito complejos de Cu(II) con pesos moleculares bajos como modelos funcionales de SOD25,26. Entre estos complejos de Cu(II), los coordinados por ácido salicílico como ligando se han descrito como modelos funcionales de SOD26. Nuestro grupo también informó complejos de Cu (II) compuestos de restos de fenolato y L-aminoácidos27. Sin embargo, estos compuestos de coordinación pueden ser tóxicos para las biomoléculas después de la liberación de iones Cu(II) de sus ligandos28. Para resolver este problema, nos centramos en la fuerte capacidad de unión de iones Cu (II) de las proteínas29.
En este estudio, como primer enfoque, investigamos la formación de una proteína híbrida compuesta de lisozima, que elegimos debido a su estabilidad y cristalinidad, y un complejo funcional de Cu (II) mimético-SOD. Se esperaba que esta proteína híbrida mimética de SOD mejorara la biocompatibilidad y estabilidad del complejo Cu (II) modelo SOD funcional.
También investigamos y confirmamos la formación de lisozima híbrida de unión a CuST (CuST@lysozyme) y dilucidamos sus propiedades espectroscópicas y electroquímicas. Además, evaluamos su actividad SOD y sugerimos un mecanismo de desproporción de O2 basado en estudios tanto experimentales como computacionales.
Para formar la proteína híbrida, nos centramos en el grupo imidazol de un solo residuo His (His15) en la lisozima como sitio de unión para el complejo Cu(II). La presencia de un grupo imidazol en la superficie de la lisozima también ayuda a la formación de un enlace de coordinación con el ion metálico. De hecho, los iones Mn(I)30, Ag(I)31, Au(I)32 y Pt(II)33 pueden unirse a este sitio de lisozima. Cuando el grupo imidazol de His15 funciona como sitio de unión, los grupos guanidinio de Arg14 y el grupo hidroxilo de Thr89 pueden interactuar con el complejo Cu(II) a través de enlaces de coordinación y/o enlaces de hidrógeno.
En este contexto, preparamos un complejo Cu (II) modelo funcional SOD con un derivado de treonina (CuST), como se muestra en la Fig. 1a 34. Se espera que se intercambie una molécula de agua en la posición ecuatorial del complejo Cu (II). con el imidazol del residuo His15 para formar la lisozima híbrida unida a CuST. La estructura propuesta de la lisozima híbrida se ilustra en la Fig. 1b. Con base en esta estructura, se espera que se formen enlaces de hidrógeno entre el grupo hidroxilo de CuST y el grupo guanidinio de la cadena lateral Arg14, mientras que se espera que el centro metálico de CuST esté coordinado por el grupo hidroxilo del residuo Thr89. Estas interacciones entre CuST y los grupos funcionales de la lisozima pueden promover la fijación rígida de CuST.
Estructuras esquemáticas de (a) CuST y (b) la estructura estimada de la lisozima de unión a CuST.
En este estudio, asumimos que His15 se une al centro Cu (II) de CuST. Para investigar el comportamiento de coordinación del imidazol, preparamos un complejo de Cu (II) unido a imidazol, CuST-Imi, haciendo reaccionar CuST con una cantidad equivalente de imidazol.
Se obtuvieron cristales de CuST-Imi verdes, delgados, transparentes en forma de placas, adecuados para cristalografía de rayos X, mediante evaporación lenta de la mezcla de reacción a temperatura ambiente (300 K) durante 3 a 4 días.
La recopilación de datos cristalográficos y las estadísticas de refinamiento para CuST-Imi se resumen en la Tabla S1. La difracción de rayos X de cristal único reveló que CuST-Imi cristaliza en el grupo espacial ortorrómbico P212121 con Z = 4. Como se muestra en la Fig. 2, CuST-Imi exhibió una geometría plana cuadrada distorsionada. Además, el centro Cu (II) estaba unido al átomo de fenolato O, al átomo de imino N y a uno de los átomos de carboxilato O para formar una estructura tridentada; se unió un ligando de imidazol adicional al sitio ecuatorial restante del centro de Cu (II). El grupo hidroxilo del residuo Thr del ligando no se coordinaba con el centro de Cu (II) y estaba orientado hacia el exterior del núcleo. La distancia entre el centro de Cu (II) y el átomo de fenolato O (1,891 Å) fue ligeramente más corta que las otras distancias Cu-N y Cu-O (1,931-1,956 Å). La distancia de enlace más corta indica que el ion Cu (II), el átomo de fenolato O y el átomo de imino N forman un anillo quelato de seis miembros estructuralmente estable. Según los ángulos de enlace N2 – Cu – N3 (171,46 °) y O1 – Cu – O2 (165,30 °), la geometría del Cu (II) en CuST-Imi se distorsionó ligeramente desde el plano cuadrado.
Estructura cristalina de CuST-Imi con elipsoides térmicos dibujados con un 50% de probabilidad. Longitudes de enlace seleccionadas (Å) y ángulos (°): Cu1–O1 = 1,891(2), Cu1–O2 = 1,937(2), Cu1–N2 = 1,956(2), Cu1–N3 = 1,931(2), O1– Cu1–N3 = 95,21(9), N3–Cu1–O2 = 83,22(9), O1–Cu1–N2 = 92,87(8), O2–Cu1–N2 = 89,65(9), O1–Cu1–O2 = 165,30( 8), y N2–Cu1–N3 = 171,46(9).
Los espectros FT-IR de CuST y CuST-Imi se muestran en la Figura S1. Tanto CuST como CuST-Imi exhibieron una vibración de estiramiento C=N a 1633 cm-1. Por el contrario, las vibraciones ν(COO–) asimétricas y ν(COO–) simétricas del grupo carboxilo aparecieron en los rangos de 1542–1535 cm–1 y 1383–1382 cm–1, respectivamente. Con base en la diferencia entre las vibraciones asimétricas y simétricas (≈ 200 cm-1), se concluyó que los grupos carboxilo de CuST y CuST-Imi se unen a los centros de Cu(II) de manera no identificada35, y las características espectrales de FT-IR son consistentes con el análisis cristalográfico.
Los espectros UV-vis de CuST y CuST-Imi se muestran en la Fig. 3. CuST dio lugar a una banda fuerte a 356 nm y una banda débil a 678 nm, mientras que CuST-Imi exhibió bandas a 357 nm y 656 nm, respectivamente. Las bandas de absorción en la región UV se atribuyen a la transferencia de carga de ligando a metal. Por otro lado, las bandas que aparecen en la región de menor energía se deben a transiciones d – d, lo que indica que estos complejos de Cu (II) tienen una geometría plana cuadrada comprimida, consistente con el análisis cristalográfico. Al comparar sus espectros UV-vis, la coordinación del imidazol con el centro Cu (II) de CuST da una banda d – d de mayor energía en la región visible (678–656 nm).
Espectros UV-vis de CuST (0,1 mM, línea en negrita) y CuST-Imi (0,1 mM, línea discontinua). Ambos espectros se midieron en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0). Recuadro: espectros ampliados en la región de 500 a 800 nm (1,0 mM).
Los espectros UV-vis del modelo mostraron la misma tendencia, es decir, un desplazamiento hacia el azul del máximo (37 nm) acompañado de un aumento en la intensidad (es decir, 356 M–1 cm–1 para CuST frente a 512 M–1 cm– 1 para CuST-Imi (Fig. 4). Para aclarar la naturaleza de la transición d – d de los complejos, se realizó un análisis de orbitales de transición natural (NTO) (Fig. 5). El análisis directo de orbitales moleculares no fue informativo porque las transiciones d – d objetivo (S0 – S3 y S0 – S4) para CuST comprenden excitaciones de 16 y 12 electrones entre los orbitales moleculares ocupados y desocupados. De manera similar, se observó excitación mixta de MO para CuST-Imi. El análisis NTO proporciona una imagen más intuitiva de los orbitales (mixtos o no) involucrados en la excitación agujero-partícula37. Este método es muy útil para excitaciones altamente complejas en el análisis de MO. Las bandas d – d para CuST están formadas por dos excitaciones, S0 – S3 (f = 0,002135761) y S0 – S4 (f = 0,003199473), y las de CuST-Imi están formadas por una excitación S0 – S2 (f = 0,002798322) . El análisis NTO de la densidad de transición para CuST muestra que la transferencia de electrones más intensa es la transferencia de carga intramolecular. La distribución de los orbitales de transición de las "partículas" (ocupados) es idéntica para ambas excitaciones estudiadas y se distribuye entre el anillo de benceno, la azometina, los grupos hidroxilo, los grupos carboxilo y los orbitales d del cobre, con una pequeña contribución de la molécula de agua coordinada. El orbital de transición de "hueco" (virtual) es muy similar a una "partícula", pero con una contribución menor del anillo de benceno, una influencia más fuerte de la molécula de agua y la participación únicamente del orbital de cobre dx2-y2. La estructura "partícula Los orbitales de transición " y "agujero" de CuST-Imi son muy similares a los de CuST. La única diferencia surge en el orbital "agujero", donde la contribución de la molécula de imidazol en CuST-Imi es más significativa que la de la molécula de agua. Junto con un cambio en las geometrías de CuST y CuST-Imi, esta es la explicación del aumento observado en la intensidad de las bandas d – d.
Espectros UV-vis calculados de CuST (línea continua) y CuST-Imi (línea discontinua). Todos los resultados se obtuvieron utilizando una aproximación TD-DFT en el nivel teórico B3LYP/6-311G(d,p). Recuadro: ampliación de los espectros en el rango de 480 a 650 nm.
Representación de orbitales de transición natural (NTO) de los pares “partícula” y “hueco” para las bandas d – d de CuST y CuST-Imi. Los pares NTO ocupan más de 1,97 de cada estado excitado (contorno de isodensidad 0,03).
Para investigar las propiedades de unión de CuST, se analizaron las características espectrales UV-vis de CuST tras la adición de lisozima. Los espectros se muestran en la Fig. 6 (región d – d) y la Fig. S2 (rango completo). En presencia de lisozima, la transición d – d de CuST cambió de 678 a 658 nm. Este desplazamiento al azul de la transición d – d es consistente con el obtenido por coordinación de imidazol a CuST (de 678 a 656 nm) y sugiere que el grupo imidazol del residuo His15 se une al centro Cu (II) en la posición ecuatorial. Además del desplazamiento hacia el azul, la intensidad de la banda d – d aumentó ligeramente, lo que indica que la simetría alrededor del centro de Cu (II) se redujo en presencia de lisozima. En general, los grupos imidazol se protonan en condiciones ácidas (pH <6) para formar cationes imidazolio. Sin embargo, se desprotonan en condiciones fuertemente básicas (pH > 14), formando un anión imidazolato. Cuando el pH de la solución está entre 6 y 14, el grupo imidazol no está ni protonado ni desprotonado. Por lo tanto, en una solución de pH 7,0, el imidazol puede unirse al centro Cu(II) en estado neutro. Aunque este comportamiento espectral UV-vis no fue suficientemente cuantitativo para determinar las constantes de unión, el cambio espectral fue cualitativamente saturado. Además, CuST-Imi se obtuvo mediante la reacción de CuST con 1 eq. de imidazol con buen rendimiento (77,8%). Con base en estos resultados, suponemos que CuST se une suficientemente bien al grupo imidazol de His15.
Espectros UV-vis de CuST (0,9 mM) en la región d – d, en diversas concentraciones de lisozima (0-1,8 mM) en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0). R: Relación de concentración de lisozima vs. CuST (Clisozima/CCuST). Estos espectros se midieron cada 0,4 pasos de R (R = 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0).
Para comprender el comportamiento electroquímico de CuST-Imi y CuST@lysozyme, se realizó voltamperometría cíclica (CV). Como control, se midió un voltamograma cíclico de lisozima para evitar señales redox en la ventana potencial del tampón fosfato. Los voltamogramas de CuST-Imi y CuST@lisozima se muestran en la Fig. 7. Cuando la velocidad de barrido fue de 5 mV/s, CuST-Imi mostró picos oxidativos (I1) y reductores (I2) a − 0,10 y − 0,51 V (frente a .Ag/AgCl), respectivamente. Estos voltamogramas se obtuvieron comenzando con barridos negativos de sus potenciales de reposo. Por otro lado, cuando no se observaron ondas anódicas en el primer escaneo, se utilizaron barridos positivos para el primer escaneo. Por lo tanto, se supuso que los procesos redox irreversibles de CuST y CuST@lisozima eran Cu(I)/Cu(II). Una velocidad de barrido más rápida dio como resultado una onda oxidativa y reductora más grande, lo que resultó en un cambio positivo/negativo en los picos oxidativos/reductores. Por el contrario, CuST@lisozima mostró picos oxidativos (I2) y reductores (I2') a − 0,04 y − 0,72 V, respectivamente, a una velocidad de barrido de 5 mV/s. A diferencia de CuST-Imi, CuST@lysozyme exhibió ondas oxidativas/reductoras vagas cuando se aumentó la velocidad de barrido. Las diferentes formas de voltamograma y comportamientos electroquímicos derivados de diversas velocidades de barrido implican que CuST se une a la lisozima casi cuantitativamente. Las vagas ondas oxidativas/reductoras de CuST@lisozima obtenidas a una velocidad de barrido más rápida pueden explicarse por una lenta transferencia de electrones debido a dos fenómenos: (1) una difusión más lenta en solución debido al gran tamaño molecular de CuST@lisozima; cuando CuST se une a la lisozima, el tamaño molecular y el peso molecular aumentan significativamente en comparación con los de CuST, y las moléculas más grandes se difunden más lentamente en solución38; y (2) inhibición estérica de la transferencia de electrones entre el centro Cu(II) de CuST@lisozima y el electrodo, ya que se espera que el centro Cu(II) de CuST@lisozima sea menos accesible al electrodo debido a su gran tamaño molecular. . Estas dos razones son consistentes con el hecho de que CuST se une a la lisozima para formar un compuesto lisozima-CuST. Aunque estos resultados electroquímicos no son suficientes para concluir que CuST se une a la lisozima, decidimos que son suficientes para implicar la unión. Aunque la lenta transferencia de electrones y los bajos potenciales redox de CuST@lisozima no son adecuados para la actividad de SOD, se estima que CuST@lisozima muestra una actividad de SOD débil porque la desproporción de O2 es catalizada por iones metálicos similares al ácido de Lewis.
Voltamogramas cíclicos de (a) CuST-Imi (1,0 mM) y (b) CuST@lisozima (CuST 1,0 mM + lisozima 2,0 mM) a diversas velocidades de barrido (5-200 mV/s). Todos los voltamogramas se midieron en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0). Se utilizaron electrodos de carbono vítreo, alambre de Pt y Ag/AgCl como electrodos de trabajo, contador y referencia, respectivamente.
La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) es una técnica eficaz para analizar tanto la estereoquímica como los cambios conformacionales de biopolímeros quirales tras la interacción con complejos de Cu (II). Por lo tanto, se utilizó espectroscopia de CD para monitorear los cambios estructurales secundarios en la lisozima tras su reacción con CuST.
Los espectros de CD de lisozima, CuST y sus mezclas en diversas proporciones se muestran en la Fig. 8. Inicialmente, el espectro de CD de la solución de lisozima contenía una fuerte banda negativa a 218 nm y un pico de hombro negativo a 232 nm. Las señales características observadas son consistentes con las de las lisozimas39,40 y las proteínas con estructuras de hélice α y cadena β. Por el contrario, CuST mostró señales positivas a 241 y 258 nm, y señales negativas a 278 y 360 nm. Estas señales se atribuyeron a los carbonos quirales del resto treonina de CuST41. Tras la adición de lisozima a la solución de CuST, la banda negativa a 278 nm se invirtió positivamente. Además, el espectro de CD no es una simple suma del de CuST y lisozima. Los espectros de CD implicaron la existencia de interacciones entre CuST y lisozima. Sin embargo, las características espectrales también podrían implicar que la estructura secundaria de la lisozima se desnaturaliza en presencia de CuST. Para investigar los cambios estructurales de la lisozima en presencia de CuST, realizamos mediciones de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS).
Espectros CD de CuST (1,0 × 10−1 mM), lisozima (0,9 × 10−1 mM) y su mezcla en varias proporciones (R = CLysozyme/CCuST). Estos espectros de CD se midieron en tampón fosfato (pH 7,0) con una concentración creciente de lisozima (0–0,9 × 10−1 mM). Para las mediciones se utilizó una cubeta de cuarzo (longitud del recorrido: 1,0 cm).
La dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) se utiliza a menudo para observar cambios en las estructuras jerárquicas de las proteínas. En el caso de la lisozima, que se utiliza en este estudio, las curvas de dispersión se dividen en cuatro rangos de valores q, a saber, menos de 0,2 Å–1, ≈ 0,25–0,5 Å–1, ≈ 0,5–0,8 Å–1, y ≈ 1,1–1,9 Å–1, correspondientes a (A) la estructura terciaria, (B) la correlación entre dominios y las estructuras intradominio, (C) las estructuras secundarias y (D) las cadenas laterales estrechamente empaquetadas en los núcleos hidrofóbicos, respectivamente42 .
Preparamos soluciones que contenían 3,75, 7,50 y 15,0 mg/mL de lisozima en tampón fosfato (pH 7,0) y en tampón acetato (pH 4,0). Se añadió una concentración diez veces mayor de CuST a estas soluciones para obtener sus curvas de dispersión de rayos X. Como se muestra en la Fig. S3, en ambas soluciones tampón, las curvas de dispersión de rayos X no cambiaron en presencia de CuST, lo que indica que no se produjo desnaturalización conformacional de la lisozima en presencia de CuST en la solución acuosa.
Se obtuvo un monocristal de CuST@lisozima adecuado para análisis cristalográfico sumergiendo monocristales de lisozima preparados utilizando el método de difusión de vapor en gota colgante. La estructura general y los datos cristalográficos de CuST @ lisozima se muestran en la Fig. S4 y la Tabla S2, respectivamente. El mapa de densidad electrónica resultante muestra que se adoptó CuST en la superficie de la lisozima para formar un compuesto 1:1 con una ocupación de 0,7 CuST. El grupo imidazol de His15 en la posición ecuatorial de CuST se coordinó con el ion Cu (II) central para formar una estructura plana cuadrada.
La estructura detallada alrededor del centro Cu(II) de CuST@lisozima se muestra en la Fig. 9. Además de la coordinación del residuo His15 con el centro Cu(II) de CuST, la cadena lateral de Thr89 estaba orientada hacia el Cu (II) centro, formando un enlace débil (la distancia entre Thr86-OH y Cu fue de 2,49 Å) en posición axial. Además, una comparación de las estructuras reveló que la cadena lateral de Arg14 se movió desde su posición original al centro de Cu (II) tras la coordinación del residuo His15 y tenía dos conformadores con ocupaciones de 0,4 y 0,6. Una de las cadenas laterales desordenadas de Arg14 formó enlaces de hidrógeno con el grupo hidroxi de CuST (2,48 y 2,69 Å). Estas características estructurales sugieren que la unidad CuST de CuST@lisozima también está fijada por varias interacciones, incluida la coordinación débil y los enlaces de hidrógeno, además de la coordinación del residuo His15 con el centro Cu(II) de CuST.
(a) Vista superior y (b) vista lateral de las estructuras cristalinas de CuST@lisozima alrededor del centro de Cu(II). El mapa de densidad electrónica 2Fo - Fc tiene un contorno de 1,0 σ. Rtrabajo/Rlibre = 0,1120/0,1291. Longitudes de enlace seleccionadas (Å) y ángulos (°): Cu1–O1 = 1,994, Cu1–O2 = 2,035, Cu1–N2 = 1,979, Cu1–N3 = 1,983, O1–Cu1–N3 = 91,87, N3–Cu1–O2 = 82,62, O1–Cu1–N2 = 94,54, O2–Cu1–N2 = 90,91, O1–Cu1–O2 = 172,48 y N2–Cu1–N3 = 173,56.
La capacidad de unión de His15 a iones metálicos se ha informado en algunos estudios que tratan con compuestos compuestos de lisozima e iones metálicos, como Mn(I)30, Ag(I)31, Au(I)32, Pt(II)33. y Rh(III)43. El compuesto Mn(I)-lisozima se formó mediante la reacción de la lisozima con [Mn(CO)3(H2O)3]+, donde el centro metálico estaba unido por tres moléculas de monóxido de carbono (≈ 1,9 Å). Además, el grupo imidazol de His15 (≈ 2,4 Å) y dos moléculas de agua (≈ 2,3 Å) interactuaron débilmente para formar una estructura octaédrica distorsionada30. En el compuesto Ag(I)-lisozima, el ion Ag(I) central está coordinado por el grupo imidazol de His15 (≈ 2,1 Å), la cadena lateral de Arg14 y Asp87 (≈ 2,5 y ≈ 2,3 Å, respectivamente) y nitrato. anión (≈ 2,0 Å) para formar una estructura piramidal triangular distorsionada31. El compuesto Au(I)-lisozima se preparó mediante la reacción del complejo Au(III) con un ligando orgánico y lisozima32. El ion Au(III) se reduce y pierde el ligando orgánico por hidrólisis tras la formación del compuesto. El ion Au(I) en el compuesto Au(I)-lisozima está unido al grupo imidazol de His15 y a la cadena lateral de Asn93, formando una estructura lineal32. Los complejos de Pt(II) como el cisplatino ([PtCl2(NH3)2]) también reaccionan con la lisozima para dar compuestos de Pt-lisozima33. El grupo imidazol de His15 (2,11 Å), el átomo de oxígeno amidato de la cadena principal (2,03 Å) y dos moléculas de amoníaco (2,03 Å) se coordinan con el ion Pt(II) para formar una estructura piramidal trigonal distorsionada33. Dos aniones cloruro se disocian tras la formación del compuesto Pt(II)-lisozima33. Los compuestos Rh (III)-lisozima se obtuvieron mediante la reacción entre RhCl3 y lisozima43. Las cadenas laterales de His15 (2,48 Å) y Arg14 (2,29 Å) se unen al centro Rh(III), formando una estructura curvada43. Otros sitios de los iones Rh(III) permanecen vacíos 43.
Aunque los centros metálicos de estos compuestos de metal y lisozima están coordinados por cadenas laterales como His15, los otros sitios de los iones metálicos están ocupados por ligandos monodentados inorgánicos o permanecen vacíos. Además, en muchos casos, los ligandos orgánicos multidentados se disocian mediante hidrólisis tras la formación de compuestos de metal-lisozima. Es de destacar que CuST@lisozima se formó sin la disociación del ligando orgánico multidentado de CuST.
Se compararon las estructuras cristalinas que rodean los centros de Cu (II) de CuST-Imi y CuST@lysozyme. Ambos iones Cu (II) estaban coordinados por oxígeno fenolato (O1), oxígeno carboxilato (O2), nitrógeno imidazol (N2) y nitrógeno imino (N3). Las distancias Cu–O1 y Cu–O2 de CuST@lisozima (1,994 y 2,035 Å, respectivamente) fueron más largas que las de CuST (1,891 y 1,936 Å, respectivamente), mientras que las longitudes de enlace Cu–N2 y Cu–N3 de CuST@ lisozima (1,979 y 1,983 Å, respectivamente) fueron ligeramente más largos que los de CuST (1,956 y 1,931 Å, respectivamente). Por el contrario, CuST@lisozima poseía ángulos de enlace N2-Cu-N3 y O1-Cu-O2 más grandes (173,56° y 172,48°, respectivamente) que CuST-Imi (171,46° y 165,30°, respectivamente), formando cuadrados planos (o cuadrados). piramidales) con menos distorsión que en CuST-Imi. Estas longitudes de enlace más largas y distorsiones más pequeñas alrededor del centro Cu (II) de CuST@lisozima se derivaron de la débil coordinación del grupo hidroxi de la cadena lateral Thr86, así como de la repulsión estérica entre la unidad CuST y la lisozima. Con base en los resultados electroquímicos antes mencionados (Fig. 7) y las mediciones espectroscópicas/cristalográficas, determinamos con seguridad que CuST se une a la lisozima.
La estructura cristalina de CuST@lisozima contiene un grupo guanidinio que pertenece a Arg14 cerca de la unidad CuST, formando enlaces de hidrógeno con el grupo hidroxi del resto Thr del ligando. Por otro lado, SOD1 también tiene un grupo guanidinio perteneciente a Arg143 sobre el sitio activo, que atrae electrostáticamente los iones O2– al centro metálico44. Por lo tanto, se espera que CuST@lysozyme muestre una mayor actividad de SOD que CuST-Imi debido a esta interacción electrostática. Las actividades SOD de CuST-Imi y CuST@lysozyme se evaluaron midiendo sus valores de IC50. Para preparar las muestras, 2 eq. de lisozima se agregaron a soluciones de CuST-Imi, CuST y CuCl2. A juzgar por los espectros UV-vis (Fig. 6) y las características electroquímicas (Fig. 7), CuST @ lisozima se formó en estas condiciones. Los valores de IC50 para CuST-Imi, CuST y CuCl2 fueron 131, 143 y 292 μM, respectivamente. La actividad de SOD fue significativamente mayor que la de la lisozima (> > 2000 µM). Tanto CuST-Imi como CuST mostraron actividades de SOD más altas que CuCl2, lo que indica que la actividad de SOD de la unidad CuST se mantuvo, incluso cuando CuST estaba unido a lisozima. Estos resultados indicaron que la lisozima adquirió actividad SOD formando un compuesto con CuST. Desafortunadamente, la actividad SOD de la unidad CuST no mejoró al unirse a la lisozima. Esto se debe a que el grupo hidroxilo de CuST forma enlaces de hidrógeno con el grupo guanidinio de Arg14, neutralizando la carga positiva. Como resultado, los iones O2– no pueden formar interacciones electrostáticas fuertes con el grupo guanidinio de Arg14, aunque los enlaces de hidrógeno juegan un papel importante en la fijación de la unidad CuST a la lisozima.
La evaluación de la actividad de SOD reveló que tanto CuST-Imi como CuST@lysozyme mostraron actividades de SOD más altas que CuCl2. Esta mayor actividad de SOD nos llevó a centrarnos en el mecanismo de desproporción del O2–. El ion azida (N3–) se utiliza ampliamente como anión modelo e inhibidor del O2– debido a su tamaño y basicidad de Lewis, que son similares a los del O2– 45. Obtener información estructural o mecanística sobre los sitios de Cu(II) de CuST-Imi y CuST@lisozima tras la desproporción de O2–, se investigaron las propiedades de coordinación del ion N3– con los sitios Cu (II). Para aclarar la naturaleza de coordinación de los aductos de CuST-Imi y CuST@lisozima con el ion N3–, se realizaron cálculos de química cuántica. Las estructuras optimizadas de los complejos de Cu(II) obtenidas mediante cálculos químicos cuánticos se muestran en la Fig. 10. En ambos casos, el ion N3– se coordina con la posición apical del plano cuadrado de sus centros de Cu(II) para adoptar un cuadrado. geometría piramidal. El enlace Cu-N formado es de 2,41 Å para ambos centros de Cu (II). La diferencia entre CuST-Imi y CuST@lisozima con el ion N3– es la naturaleza del enlace de hidrógeno entre el átomo de nitrógeno del ion N3– coordinado y el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo. El mismo átomo de nitrógeno se coordina con el centro Cu (II) y forma enlaces de hidrógeno con el aducto CuST-Imi. En CuST@lisozima, un átomo de nitrógeno forma un enlace de coordinación con el centro Cu(II) y otro átomo de nitrógeno terminal forma un enlace de hidrógeno con el grupo hidroxilo.
Estructuras optimizadas de (a) CuST-Imi y (b) CuST@lisozima con ion N3. Se muestran las longitudes de enlace seleccionadas (Å) y los ángulos (°).
El comportamiento espectral UV-vis de CuST-Imi y CuST@lisozima en presencia de iones N3– se muestra en la Fig. 11. A medida que se agregaron iones N3–, el máximo de absorción a 657 nm aumentó para cada compuesto, correspondiente a su d –d transiciones. Estos aumentos en sus máximos de absorción indican que la coordinación de los iones N3– con sus centros de Cu (II) reduce las simetrías en las estructuras cercanas a los iones metálicos centrales. Los espectros ópticos modelo para los aductos de CuST, CuST-Imi y CuST@lisozima con iones N3– se muestran en la Fig. S5. Los espectros simulados muestran una intensidad creciente de las transiciones d – d en la región de 400 a 600 nm tras la coordinación de los iones N3– con los complejos de Cu (II). Después de la coordinación axial del ion N3– con los centros de Cu(II), resultó una geometría de coordinación piramidal cuadrada ligeramente distorsionada, que era menos simétrica que la estructura plana cuadrada inicial de los complejos de Cu(II).
Espectros UV-vis de (a) CuST-Imi (1,0 mM) y (b) CuST@lisozima (CuST 1,0 mM + lisozima 2,0 mM) en presencia de 0, 10, 50 y 100 eq. de NaN3 en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0).
La espectroscopia EPR se utiliza a menudo para obtener información estructural sobre complejos de Cu (II) debido a su sensibilidad a los cambios estructurales alrededor de los centros de Cu (II). Los cambios espectrales de EPR en presencia de iones N3– en CuST-Imi y CuST@lisozima se muestran en la Fig. 12, las comparaciones de los espectros de EPR medidos y simulados se muestran en la Fig. S6, y las relaciones entre sus g// y |A//| Los valores se resumen en la Fig. 13 y la Tabla S3. En ausencia del ion N3–, CuST-Imi exhibió valores g// y g⊥ de 2,25 y 2,07, mientras que los de CuST@lisozima fueron 2,24 y 2,06, respectivamente. Ambos espectros de EPR mostraron valores de g// mayores que los valores de g⊥, lo que indica que sus electrones no apareados estaban ubicados en sus orbitales dx2-y2, lo que sugiere que las estructuras alrededor del centro de Cu(II) de CuST-Imi y CuST@lisozima eran planas cuadradas. o piramidal cuadrado46. CuST@lysozyme poseía g// más pequeño y |A//| más grande. valores que CuST-Imi (Fig. 13, Tabla S3). Generalmente, los complejos de Cu(II) con estructuras planas cuadradas distorsionadas muestran g// más grande y |A//| más pequeño. valores que los de estructuras planas cuadradas no distorsionadas 47. Con base en estas tendencias, cuanto más pequeño g// y más grande |A//| Los valores de CuST@lisozima que los de CuST-Imi son consistentes con sus estructuras cristalinas, específicamente la menor distorsión en relación con la de CuST-Imi.
Espectros EPR de (a) CuST-Imi y (b) CuST@lisozima en presencia de NaN3. Las líneas en negrita, discontinua y de puntos representan los espectros obtenidos en ausencia de NaN3, en presencia de 50 eq. de NaN3, y en presencia de 100 eq. de NaN3, respectivamente. Todas las muestras se prepararon como soluciones 1 mM de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0) que contenía etilenglicol al 10 %, medido a –196 ˚C.
Cambios en g// y |A//| valores de CuST (círculo rojo), CuST-Imi (círculos naranjas) y CuST@lisozima (círculos azules) tras la adición de 0, 50 y 100 eq. de NaN3. Los círculos rellenos y vacíos indican los valores obtenidos experimental y teóricamente, respectivamente.
En presencia de iones N3–, los g// y |A//| Los valores de CuST-Imi y CuST@lisozima cambiaron gradualmente y ambos compuestos exhibieron g// más grande y |A//| más pequeña. valores. Estos cambios son típicos del cambio estructural de plano cuadrado a piramidal cuadrado tras la coordinación axial a complejos de Cu (II) con estructuras planas cuadradas47. Por lo tanto, estos cambios espectrales de EPR indican que los iones N3– estaban coordinados axialmente con el centro Cu (II) de CuST-Imi y CuST @ lisozima. Estos comportamientos espectroscópicos de EPR son consistentes con el análisis cristalográfico, ya que CuST @ lisozima tiene suficiente espacio para unirse al ion N3– en el centro Cu (II).
Los g// y |A//| obtenidos teóricamente Los valores de CuST-Imi y CuST@lysozyme y sus aductos N3– se calcularon mediante aproximación DFT y se resumen en la Fig. 13 y la Tabla S4. En este cálculo, g// y |A//| Los valores se evaluaron como promedios de gx, gy y |Az| valores. En el CuST, el |A//| Los valores disminuyen ligeramente ya que el entorno de coordinación del ion Cu (II) no se altera significativamente porque en esta reacción, el anión N3 deposita la molécula de metanol coordinada axialmente. Como se muestra en la Fig. 10, las geometrías de coordinación de CuST-Imi y CuST@lysozyme cambiaron de plano cuadrado a piramidal cuadrado tras la coordinación axial del ion N3–. Los cambios estructurales se reflejan en g// y |A//| valores, de la siguiente manera: el modelado DFT reveló que CuST-Imi y CuST@lysozyme mostraron valores de g// más grandes tras la coordinación del ion N3–, mientras que su |A//| los valores 30 (para CuST-Imi) y 37 MHz (para CuST@lisozima) disminuyeron con la coordinación N3–. Estos resultados teóricos son consistentes con los obtenidos experimentalmente g// y |A//| valores tras la unión de N3–.
Según estos hallazgos, los iones O2– se unieron axialmente al ion Cu (II) de CuST @ lisozima.
Se realizaron cálculos de química cuántica para estimar el mecanismo de desproporción de O2 catalizado por CuST@lisozima. Como compuesto modelo de CuST@lisozima, se empleó un compuesto modelo simplificado coordinado por un ligando adicional con un marco Arg-His (CuST-Arg-His) para ahorrar recursos informáticos. Al estimar el mecanismo de desproporción de O2, asumimos cinco estados y cinco pasos, como se muestra en la Fig. 14. Se asumieron cinco estados: (A) estado de reposo de Cu(II), (B) estado de unión de O2 a Cu(II) , (C) estado de reposo de Cu (I), (D) estado de Cu (I) interactuado con O2 y (E) estado de Cu (II) interactuado con H2O2. También se supusieron los siguientes pasos: (1) Cu(II)–O2– paso de formación de especies, (2) O2–-paso de oxidación, (3) O2–-paso de formación de especies de Cu(I) interactuado, (4) Paso de formación de especies de Cu (II) que interactúa con H2O2 y (5) paso de salida de H2O2.
Mecanismo de desproporción de O2 propuesto teóricamente. Se empleó un compuesto modelo simplificado coordinado por un ligando adicional con una estructura Arg-His (CuST-Arg-His).
En el estado de reposo de Cu (II), CuST – Arg – His está en estado doblete porque el centro de Cu (II) tiene un electrón desapareado y la estructura calculada de CuST-Imi muestra una geometría plana ligeramente cuadrada. Estos resultados fueron consistentes con el análisis cristalográfico y las propiedades espectroscópicas EPR de CuST-Imi.
En el estado de reposo de Cu (II), los iones O2– se unen a los iones Cu(II) para formar especies de Cu(II) que se unen a O2. Debido a los electrones desapareados de los iones Cu(II) y O2–, se pueden formar estados singlete o triplete. Según una comparación de sus estabilidades, el estado triplete proporciona 20,39 kcal/mol menos de energía que el estado singlete (Fig. S7). En este estado, los iones O2– se unen a los iones Cu(II) para formar una estructura piramidal cuadrada distorsionada. El ion O2– que se une a Cu (II) formó un enlace de hidrógeno con el grupo hidroxilo del ligando. Cabe mencionar que los enlaces de coordinación y de hidrógeno los forman el mismo átomo de oxígeno. Se espera un enlace de hidrógeno similar a partir de la estructura optimizada de CuST-Imi de unión a N3, como se menciona en la Fig. 10.
En condiciones próticas, el H+ interactúa con el carboxilato de la especie Cu(II) que se une al O2 para formar el estado de reposo Cu(I). En este paso, el ion O2– unido fue oxidado a O2 por el ion Cu(II). En este estado, el carboxilato del ligando fue protonado, dejando el ion Cu(I).
Los iones O2– adicionales se unen a las especies de Cu(I) en reposo para formar especies de Cu(I) que interactúan con O2. En este estado, el anión O2– no se coordina con el ion Cu(I), sino que se fija mediante los enlaces de hidrógeno formados entre el grupo carboxilo y el guanidinio de la cadena lateral de Arg.
En las especies Cu(I) que interactúan con O2, los iones H+ reaccionan con el anión O2– para formar especies Cu(II) que interactúan con H2O2. En este estado, la molécula de H2O2 tampoco se une al ion Cu(II), sino que está fijada por cuatro enlaces de hidrógeno con los grupos carboxilato y guanidinio. También se ha sugerido el mecanismo reductor de O2 que no coordina el O2 para el CuZnSOD23 nativo.
En el último paso, la molécula de H2O2 interactúa con el ion Cu(II) para recuperar el estado de reposo del Cu(II).
Se preparó una nueva proteína híbrida compuesta por un complejo de Cu(II) activo para SOD y lisozima (CuST@lysozyme), y se estudiaron sus propiedades espectroscópicas y electroquímicas. Según el análisis cristalográfico, CuST se fija en la lisozima mediante un grupo imidazol coordinado ecuatorialmente de la cadena lateral His15, un grupo hidroxilo coordinado axialmente de Thr89 y un enlace de hidrógeno entre el grupo hidroxilo de CuST y el grupo guanidinio de Arg14. residuos (Fig. 9). Tanto CuST-Imi como CuST@lysozyme mostraron mayores actividades de SOD que CuCl2 y lisozima. Según las evaluaciones de la actividad de SOD, la lisozima adquirió actividad de SOD formando un compuesto con CuST. Los espectros UV-vis y EPR mostraron que el ion N3- estaba coordinado con el centro Cu(II) de CuST@lisozima (Figs. 11 y 12), lo que sugiere que el ion O2- también puede coordinarse con el centro Cu(II). . Se propuso un mecanismo de desproporción de O2 basado en simulaciones químicas espectroscópicas y cuánticas. Nuestro estudio proporciona información valiosa para el diseño racional de nuevos candidatos a fármacos terapéuticos de SOD que eviten reacciones secundarias debido a la descomposición del complejo mimético de SOD. Para mejorar la estabilidad de la proteína híbrida en fluidos biológicos como plasma y citosol, se llevaron a cabo las siguientes tres estrategias. (1) Para suprimir la disociación de ligandos, se utilizaron complejos de metales de transición tardía como compuestos de unión para la lisozima. (2) Para aumentar la interacción entre los complejos y la lisozima, se utilizaron ligandos con restos de enlaces de hidrógeno. (3) Dado que la lisozima contiene muchas cadenas laterales básicas, la introducción de grupos funcionales ácidos a los ligandos mejoró la estabilidad de los compuestos de metal-lisozima. Al mejorar la estabilidad de los compuestos de metal y lisozima utilizando estos métodos, se esperan debates más profundos sobre sus aplicaciones terapéuticas.
Los reactivos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (Osaka, Japón), Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokio, Japón) y Kanto Chemical Co. Inc. ( Tokio, Japón). Todos los reactivos eran de la más alta calidad comercial y se utilizaron sin purificación adicional.
Los análisis elementales (C, H y N) se realizaron utilizando un analizador CHNS/O Perkin-Elmer 2400 II en la Universidad de Ciencias de Tokio. Los espectros IR se registraron en un espectrofotómetro JASCO FT-IR 4200 (JASCO, Tokio, Japón) en el rango de 4000–400 cm-1 a 298 K. Los espectros UV-vis se midieron usando un espectrofotómetro JASCO V-570 en el rango de 800 - 250 nm a temperatura ambiente. Las concentraciones de la solución oscilaron entre 0,1 y 1,0 mM y se utilizaron células de cuarzo (longitud del recorrido: 1,0 cm) para contener las muestras. Los espectros de CD se midieron utilizando un instrumento JASCO J-725. Las concentraciones de la solución fueron 0,1 mM (CuST) y 0,09 mM (lisozima), respectivamente. Para las mediciones se utilizaron células de cuarzo (longitud del recorrido: 1,0 cm). Las mediciones SAXS se llevaron a cabo en la línea de luz BL-10C de la fuente de radiación sincrotrón de 12 keV en la Fábrica de Fotones de la Organización de Investigación de Aceleradores de Alta Energía (KEK, Tsukuba, Japón). Las concentraciones de lisozima y CuST fueron de 0,25 a 1,0 mM y 1,0 mM, respectivamente. Los espectros EPR de los complejos se registraron en un espectrómetro Bruker EMX-nano EPR (banda X) a 77 K, donde se midieron soluciones 1 mM de CuST-Imi y CuST@lisozima como muestras en tubos de cuarzo. Las propiedades electroquímicas de los complejos sintetizados se midieron mediante voltamperometría cíclica (ALS/DY2323 BI-POTENTIOSTAT) en una solución tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0). Se utilizaron electrodos de carbono vítreo, alambre de Pt y Ag/AgCl como electrodos de trabajo, contador y referencia, respectivamente. Las curvas CV de CuST-Imi (1,0 mM), CuST@lisozima (CuST 1,0 mM) y lisozima (2,0 mM) se midieron durante tres ciclos bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente con una velocidad de barrido potencial de 5 a 200 mV. 1.
El complejo Cu(II) CuST se sintetizó utilizando un método publicado34.
Se disolvieron L-treonina (0,119 g, 1 mmol), salicilaldehído (0,122 g, 1 mmol) y KOH (0,056 g, 1 mmol) en 15 ml de metanol y se agitaron durante 1 h a temperatura ambiente. Luego se añadió a esta solución una solución en metanol (15 ml) de acetato de cobre (II) monohidrato (0,182 g, 1 mmol). Después de agitar durante 15 minutos, se añadió una solución en metanol (5 ml) de imidazol (0,068 g, 1 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 a 4 días, produciendo monocristales verdes en forma de aguja adecuados para mediciones cristalográficas de rayos X.
Rendimiento: 0,275 g (77,8%). Análisis elemental. Calculado para C14H15N3O4Cu, C: 47,66 %, H: 4,29 %, N: 11,91 %, Encontrado: C: 47,64 %, H: 3,94 %, N: 11,79 %.
Primero, se preparó un monocristal de lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL) utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante. Como solución de cristalización se utilizó tampón de ácido acético-acetato de sodio 0,1 M (pH 4,7) que contenía NaCl al 2-6% (p/v). Se añadieron cinco microlitros de solución de lisozima (50 mg/ml) a la solución de cristalización (5 µl) para formar monocristales de lisozima. Luego, los cristales se transfirieron a una gota que comprendía una mezcla de 10 µl de solución de cristalización y 5 µl de solución saturada de CuST en MeOH; esta gota se incubó durante unos minutos a 4 °C. Los cristales se lavaron sobre la solución de cristalización original para eliminar el exceso de CuST de la superficie del cristal. Los cristales se empaparon en una solución de cristalización que contenía 20% de etilenglicol durante unos minutos y luego se enfriaron instantáneamente en nitrógeno líquido.
Los datos de intensidad de rayos X de los cristales empapados en CuST se recolectaron a 100 K utilizando un detector Eiger X16M (Dectris) en BL-17A en la Fábrica de Fotones de la Organización de Investigación de Aceleradores de Alta Energía (KEK, Tsukuba, Japón). La longitud de onda de la radiación sincrotrón, la distancia entre la muestra y el detector, el rango de oscilación y el tiempo de exposición fueron 0,98 Å, 95 mm, 0,5° (total 180°) y 0,2 s, respectivamente. La resolución más alta fue de 0,92 Å, procesada con XDS48. Los cristales pertenecían al grupo espacial tetragonal (P43212), y la estructura se resolvió mediante reemplazo molecular con MOLREP49 del paquete de programa CCP450 utilizando un modelo HEWL nativo perteneciente al mismo grupo espacial (código PDB: 5LYT)51 como modelo de búsqueda. La construcción y el refinamiento del modelo se realizaron utilizando el software COOT52 y PHENIX53, respectivamente. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla S2. Las coordenadas atómicas y los factores estructurales se depositaron en el PDB con el código de acceso 7YRK. Se prepararon imágenes de las estructuras cristalinas utilizando PyMOL54.
Se pegó un monocristal de CuST-Imi encima de la fibra de vidrio y se recubrió con una fina capa de resina epoxi para medir los datos de difracción. Los datos de intensidad se recopilaron utilizando un difractómetro CCD Bruker APEX2 con radiación Mo-Kα monocromada con grafito (λ = 0,71073 Å). El análisis de los datos se realizó utilizando el paquete de software SAINT. Las estructuras se resolvieron mediante métodos directos utilizando SHELXS-97, se expandieron mediante técnicas de Fourier y se refinaron utilizando métodos de mínimos cuadrados de matriz completa basados en F2 (SHELXL-97)55. Se aplicó una corrección de absorción empírica mediante el programa SADABS. Todos los átomos distintos de hidrógeno se localizaron y refinaron fácilmente utilizando parámetros térmicos anisotrópicos. Todos los átomos de hidrógeno se ubicaron en posiciones calculadas geométricamente y se refinaron utilizando modelos de conducción.
Las actividades SOD de los complejos Cu(II) CuST-Imi y CuST@lisozima se evaluaron utilizando el kit de ensayo SOD-WST (Dojindo, Kumamoto, Japón), que se basa en el método xantina-xantina oxidasa, según las instrucciones del fabricante. . La absorbancia se midió a 450 nm en una placa de 96 pocillos utilizando un lector de microplacas iMark (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.).
Todos los cálculos de DFT se realizaron utilizando el programa Gaussian 0956. Para cada compuesto presentado en este trabajo se realizó una optimización geométrica completa, a partir de las estructuras cristalográficas disponibles. Las geometrías se optimizaron utilizando funcionales B3LYP57 con un conjunto de bases de valencia dividida (6-311G(d,p))58,59. Todos los puntos estacionarios (SP) se identificaron como mínimos (no se detectaron vibraciones normales con frecuencias imaginarias) y los estados de transición se identificaron como los primeros estados excitados (una frecuencia imaginaria). Todos los sistemas de capa abierta fueron tratados con un formalismo irrestricto, sin restricciones de simetría. Para evaluar la aparición de contaminación por espín en los cálculos de U-DFT, el valor obtenido para
Los datos cristalográficos y las intensidades de difracción (CIF) informados en este artículo se han depositado en el Centro de datos cristalográficos de Cambridge (CCDC) con el número de referencia (2194652). Las coordenadas atómicas y los factores de estructura de CuST@lysozyme se depositaron en el Protein Data Bank (PDB) con el código de acceso 7YRK. Todos los datos están disponibles en el texto principal o en información complementaria, y/o del autor correspondiente previa solicitud.
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Agradecemos al Dr. Nobutaka Shimizu (KEK, Japón) por las mediciones SAXS. También agradecemos a los miembros de la línea de luz PF por su ayuda en la recopilación de datos de intensidad de rayos X. Los números de proyecto de los experimentos de difracción de rayos X en PF son 2019G512, 2020P003 y 2022G012. Este trabajo fue financiado parcialmente por una subvención para la investigación científica (A) KAKENHI (20H00336). Los cálculos químicos cuánticos se realizaron utilizando los recursos del centro de uso colectivo SFedU, “The High-Performance Computing” y GENCI (Francia), proyecto gen7041. Esta investigación (simulaciones de química cuántica) fue apoyada financieramente por el Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia No. 0852-2020-0019 (asignación estatal en el campo de la actividad científica, Universidad Federal del Sur, proyecto 2020 No BAZ0110/20- 1-03EH). Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.com) por la edición en inglés.
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Ciencias de Tokio, 1-3 Kagurazaka, Shinjuku-ku, Tokio, 162-8601, Japón
Tetsundo Furuya, Daisuke Nakane, Kenichi Kitanishi, Natsuki Katsuumi y Takashiro Akitsu
Universidad Jean Monnet Saint-Etienne, CNRS, Institut d Optique Graduate School, Laboratoire Hubert Curien UMR 5516, 42023, Saint-Étienne, Francia
Arshak Tsaturyan
Instituto de Química Física y Orgánica, Universidad Federal del Sur, 194/2 Stachka Ave., Rostov-On-Don, 344090, Rusia
Arshak Tsaturyan
Departamento de Química, Universidad Federal del Sur, 7 Zorge Str., Rostov-On-Don, 344090, Rusia
Igor N. Shcherbakov
Escuela de Graduados en Ciencias e Ingeniería, Universidad de Ibaraki, 4-12-1 Nakanarusawa, Hitachi, Ibaraki, 316-8511, Japón
Masaki Unno
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TA supervisó este estudio; TF y DN concibieron los experimentos; MU y KK midieron y analizaron la estructura de rayos X de la proteína; TF y NK realizaron otros experimentos; e IS y AT realizaron los cálculos DFT. DN, TF y AT escribieron el manuscrito y TA lo revisó.
Correspondencia a Daisuke Nakane o Takashiro Akitsu.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
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Reimpresiones y permisos
Furuya, T., Nakane, D., Kitanishi, K. et al. Una nueva proteína híbrida compuesta por un complejo de Cu (II) activo con superóxido-dismutasa y lisozima. Representante científico 13, 6892 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33926-1
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Recibido: 15 de septiembre de 2022
Aceptado: 20 de abril de 2023
Publicado: 27 de abril de 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33926-1
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