Construcción de una subunidad | Grupo de resina Guizhou

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 19183 (2016) Citar este artículo

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Las metalochaperonas son proteínas de unión a metales diseñadas para entregar el metal apropiado a una proteína objetivo. El metal suele transferirse entre diferentes proteínas. En este estudio, descubrimos que se transfirió metal entre la misma subunidad de una nitrilo hidratasa mutante (NHase). Varias "proteínas activadoras" median en el tráfico de iones metálicos hacia NHasas. Construimos NHasas de fusión fusionando las subunidades β y α y/o las "proteínas activadoras" de la NHasa de Pseudomonas putida. Las NHasas de fusión exhibieron mayor termoestabilidad y tolerancia a altas concentraciones del producto amida. El mecanismo de incorporación de cobalto cambió de un patrón de intercambio de subunidades propias a un patrón de chaperona molecular específico de apoproteína in vivo y un patrón de metalochaperona in vitro. En particular, la transferencia de cobalto se produjo entre la misma subunidad α en el patrón de metalochaperona. Estos resultados no solo demostraron la superioridad de las NHasas de tipo fusión, sino que también revelaron un patrón innovador de transferencia de iones metálicos en la biosíntesis de metaloproteínas.

Las metaloproteínas se han caracterizado intensamente durante décadas y más de un tercio de todas las proteínas son metaloproteínas1. Las funciones mediadas por iones metálicos en las proteínas incluyen la transferencia de electrones, el transporte de oxígeno, la regulación genética y la estabilización de estructuras2. En una revisión se informaron varios mecanismos generales de biosíntesis de metalocentros3; uno de ellos es el suministro de metalochaperonas de un ion metálico o moléculas que contienen metal. Las metalochaperonas son proteínas de unión a metales diseñadas para entregar el ion metálico apropiado o las moléculas que contienen metal a una proteína objetivo. La proteína diana y la metalochaperona suelen ser proteínas diferentes y la proteína diana exhibe especificidad de ligando y más afinidad por el ion metálico.

La nitrilo hidratasa (NHase, EC 4.2.1.84)4 es una enzima que cataliza la hidratación de una amplia gama de nitrilos a las amidas correspondientes5. La enzima está compuesta de subunidades α y β y contiene hierro no hemo (Fe-NHase)6 o cobalto no corren (Co-NHase)7,8. El tráfico de iones metálicos hacia NHasas está mediado por las correspondientes “proteínas activadoras”9. Se ha demostrado que los activadores de Fe-NHases actúan como metalochaperonas10, mientras que las "proteínas activadoras" actúan como "chaperonas de autointercambio de subunidades" para la incorporación de cobalto en la mayoría de los Co-NHases9,11,12.

El intercambio de autosubunidades es uno de los pasos de maduración postraduccional de la familia Co-NHase11. La proteína activadora existe como un complejo con la subunidad α de NHase y la incorporación de cobalto en NHase depende del intercambio de subunidad α entre la subunidad α libre de cobalto de NHase y la subunidad α del complejo que contiene cobalto9. El intercambio de autosubunidades es bastante diferente de los mecanismos generales actualmente conocidos de biosíntesis de metalocentros9,11,13, que fueron informados en una revisión por Kuchar y Hausinger3, de la siguiente manera: (i) unión reversible de iones metálicos; (ii) suministro de metalochaperona de un ion metálico o cofactor; (iii) modificación postraduccional que crea un sitio de unión al metal; (iv) unión sinérgica de un metal con otro componente; (v) síntesis de cofactores que contienen metales; (vi) incorporación de metal junto con transferencia de electrones; y (vii) requisito de una chaperona molecular específica de apoproteína, etc. El intercambio de autosubunidades se descubrió por primera vez en la L-NHasa de Rhodococcus rhodochrous J19 y, posteriormente, en la H-NHasa de la misma cepa11 y se especula que ocurre en varias otras Co-NHasas y en una enzima de la familia NHasa, la tiocianato hidrolasa, que también contiene un centro de cobalto no corrosivo único con dos ligandos de cisteína modificados postraduccionalmente12,15. Las “chaperonas de autointercambio de subunidades” exhiben una función proteica sorprendente en contraste con las metalochaperonas en la biosíntesis de metalocentros y las chaperonas moleculares en el plegamiento de proteínas9,11.

La NHase se utiliza ampliamente en la producción industrial de acrilamida y nicotinamida4 altamente purificadas. Sin embargo, la mayoría de los NHas con alta actividad son inestables durante la aplicación industrial16. Por ejemplo, las NHasas de Pseudomonas chlororaphils B23 y Rhodococcus sp. N-774 son estables por debajo de 20 °C17,18 y la NHasa de Rhodococcus rhodochrous J1 es simplemente estable entre 10 y 30 °C19. Debido a que la hidratación del nitrilo es una reacción exotérmica, es necesario mantener una temperatura de reacción baja para estabilizar las NHasas mediante refrigeración, lo que generalmente causa un enorme costo de energía redundante16. Además, en la fabricación industrial es necesaria la tolerancia a altas concentraciones del producto amida. Por lo tanto, se requiere una NHasa más estable con alta actividad y alta tolerancia para la fabricación industrial.

La fusión de genes de subunidades puede mejorar la estabilidad de las proteínas20,21,22. La fusión de genes es una estrategia para fusionar dos o más genes previamente distintos en un único marco de lectura abierto. Además, se ha informado que los eventos de fusión tienden a optimizar el ensamblaje al simplificar las topologías de los complejos proteicos23. Recientemente, se ha predicho una nueva estructura genética de NHasa en el eucariota Monosiga brevicollis24. Las dos subunidades de NHase normalmente separadas (subunidades β y α) están fusionadas en un péptido en esta NHase. Se prevé que la NHasa de fusión tendrá características beneficiosas, como mayor actividad, mayor estabilidad o nuevas especificidades de sustrato24. Por tanto, la estrategia de fusión de genes podría ser una herramienta eficaz para mejorar la aplicación de la NHasa.

En este estudio, construimos un nuevo tipo de NHase con un solo polipéptido fusionando las subunidades β y α de la NHase de Pseudomonas putida NRRL-18668 (P. putida). La NHase de fusión exhibió una termoestabilidad y una tolerancia al producto significativamente mayores que el tipo salvaje. La proteína activadora P14K también era necesaria para la activación de la NHasa de fusión. Además, P14K se fusionó aún más con la NHasa de fusión de las subunidades β y α, lo que resultó en la formación de otra NHasa de fusión. El mecanismo de incorporación de cobalto de la NHasa cambió debido a estas alteraciones estructurales. El complejo α(P14K)2 (se combinaron dos P14K con la subunidad α) desempeñó un papel como metalochaperona para transferir un ion cobalto a las NHasas de fusión in vitro. La transferencia de cobalto se produjo en la misma subunidad α entre la NHase libre de cobalto (apo-NHase) y el complejo α(P14K)2, lo que reveló un patrón innovador de transferencia de iones metálicos en la biosíntesis de metaloproteínas. Además, lo más probable es que P14K actúe como una chaperona molecular específica de apoproteína para la incorporación de cobalto in vivo.

La NHasa de P. putida se construyó previamente y se sobreexpresó con éxito en Escherichia coli BL2125. Basándonos en la estructura genética de Monosiga brevicollis, construimos dos NHas mutantes con fusión de genes de subunidades. Los genes de las subunidades β y α previamente distintos (genes B y A) se fusionaron con un conector (dipéptido, prolina-glicina) en un gen (BA); el gen fusionado (BA) se insertó en el plásmido pET28a, dando como resultado pET28a-(BA) (Fig. 1a). A continuación, se insertó el gen activador P14K aguas abajo del gen mutante (BA), lo que dio como resultado pET28a-(BA)P14K. Los transformantes que albergaban pET28a-(BA) y pET28a-(BA)P14K se usaron para expresar NHasa. Como resultado, se detectó actividad NHasa y cada una de las bandas de proteínas correspondientes de los transformantes fue obvia en el SDS-PAGE, lo que indica que las dos NHasas de fusión se expresaron con éxito (Fig. 1b). En lo sucesivo, las NHas de fusión codificadas por el gen (BA) y (BA)P14K se denominarán respectivamente NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K.

Construcción, expresión y purificación de las NHasas recombinantes.

(a) Organización genética para la construcción de un conjunto de plásmidos. (b) SDS-PAGE de un extracto libre de células de cada transformante. 1, marcador; 2, NHase de tipo salvaje; 3, NHasa-(BA); 4, NHase-(BA)P14K; 5, NHase-(BAP14K). (c) SDS-PAGE de las enzimas purificadas. 1, marcador; 2, NHase de tipo salvaje; 3, NHasa-(BA); 4, NHasa-(BA)P14K; 5, NHase-(BAP14K).

NHase- (BA) y NHase- (BA) P14K se purificaron y caracterizaron (Fig. 1c) y se compararon con la NHase de tipo salvaje. Como se muestra en la Tabla 1, la actividad específica y kcat de NHase-(BA)P14K fueron mayores que las de NHase de tipo salvaje, lo que demuestra que la fusión de las subunidades β y α aumentó la actividad. El contenido de cobalto de NHase-(BA) fue aproximadamente el 14% de NHase-(BA)P14K, lo que indica que P14K también era necesario para la incorporación de cobalto, incluso en la fusión NHase (Tabla 1). La constante de Michaelis (valor Km) de NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K fue mayor (aproximadamente 1,5 veces) que la de la NHase de tipo salvaje, lo que indica que la fusión de las subunidades β y α podría restringir el proceso de unión del sustrato al centro activo. El análisis de masa MALDI-TOF de NHase- (BA) P14K indicó que NHase- (BA) P14K tiene la longitud total de βα (Fig. S1). La NHase de tipo salvaje es un tetrámero (α2β2); La masa molecular de las enzimas de fusión se determinó mediante cromatografía de filtración en gel. Las masas moleculares de NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K fueron 97,8 kDa y 85,1 kDa, respectivamente (Fig. 2). Debido a que la masa molecular calculada de βα fusionado es 49,2 kDa, ambas NHasas de fusión deberían ser dímeros [(βα)2]. Utilizando el análisis de espectros de dicroísmo circular (CD) de UV lejano, realizamos una comparación detallada de cada propiedad entre NHase, NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K de tipo salvaje. Los espectros de NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K fueron diferentes de los de la NHase de tipo salvaje (Fig. 3a), lo que indica que la estructura secundaria de NHase-(BA) o NHase-(BA)P14K no es el mismo que el de la NHase de tipo salvaje.

Determinación de la masa molecular y estructuras de las NHasas de fusión.

Proteínas marcadoras utilizadas para la filtración en gel: (i) glutamato deshidrogenasa (levadura) (290 kDa); (ii) lactato deshidrogenasa (corazón de cerdo) (142 kDa); (iii) enolasa (levadura) (67 kDa); (iv) mioquinasa (levadura) (32 kDa); y (v) citocromo c (corazón de caballo) (12,4 kDa).

Espectros de absorción CD de UV lejano (a) y UV-Vis (b – d) de la NHasa de tipo salvaje y las NHas de fusión.

P14K era necesaria para la incorporación de cobalto en la NHasa de tipo salvaje y las NHas de fusión. Intentamos construir un gen de proteína de fusión de tres subunidades (BAP14K), que fusionó aún más P14K con el extremo (βα)-carboxilo de NHase-(BA). El gen fusionado (BAP14K) se insertó en el plásmido pET28a, dando como resultado pET28a-(BAP14K) (Fig. 1a). Se usó el transformante que albergaba pET28a-(BAP14K) para la expresión de NHase. Como resultado, se detectó la banda proteica correspondiente de la NHase mutante en el SDS-PAGE (Fig. 1b), lo que indica que la NHase de fusión se expresó con éxito. En lo sucesivo, la fusión NHase codificada por el gen (BAP14K) se denomina NHase-(BAP14K). La NHasa- (BAP14K) se purificó y caracterizó (Fig. 1c). Como se muestra en la Tabla 1, la actividad específica y kcat de NHase-(BAP14K) fueron mayores que las de NHase de tipo salvaje y las diferencias de la actividad específica y kcat entre NHase-(BAP14K) y NHase-(BA)P14K fueron pequeñas. . En comparación con la NHase y la NHase-(BA)P14K de tipo salvaje, el valor de Km de la NHase-(BAP14K) fue el más alto, lo que indica que la fusión de P14K restringió aún más la unión del sustrato. La masa molecular de la NHasa-(BAP14K) se determinó mediante cromatografía de filtración en gel. La masa molecular de la NHasa-(BAP14K) fue de 150,6 kDa. Debido a que la masa molecular calculada de la fusión βαP14K es 67,0 kDa, la NHase-(BAP14K) debe ser dímera [(βαP14K)2] (Fig. 2). El espectro de CD de NHase- (BAP14K) fue similar al de NHase- (BA) P14K (Fig. 3a), lo que indica que la estructura secundaria de NHase- (BAP14K) es similar a la de NHase- (BA )P14K pero es diferente del tipo salvaje.

Debido a que la NHase-(BAP14K) exhibió una mayor actividad NHase que el tipo salvaje, estudiamos el efecto de la ubicación de P14K en la actividad NHase de fusión. Diseñamos dos genes NHase de fusión de tres subunidades más, (BP14KA) y (P14KBA). En (BP14KA), el gen P14K estaba ubicado entre los genes de las subunidades β y α; en (P14KBA), el gen P14K estaba por delante del gen de la subunidad (βα) (Fig. 1a). Los transformantes que albergaban pET28a-(BP14KA) y pET28a-(P14KBA) se usaron para expresar respectivamente NHase-(BP14KA) y NHase-(P14KBA). Las NHasas de fusión se purificaron y ensayaron. La actividad de NHase-(BP14KA) fue de 148,6 U/mg, aproximadamente el 32% de la de NHase-(BAP14K) (452,5 U/mg); la actividad de la NHasa-(P14KBA) fue de 76,7 U/mg, aproximadamente el 17% de la de la NHasa-(BAP14K). Estos hallazgos demostraron que la ubicación de P14K afectó significativamente la actividad de fusión NHases. Cuando la P14K se ubicó aguas abajo del extremo (βα)-carboxilo, la NHasa de fusión mostró la mayor actividad.

La actividad específica y kcat de NHase-(BA)P14K y NHase-(BAP14K) fueron mayores que las de la NHase de tipo salvaje; por lo tanto, los comparamos aún más en términos de termoestabilidad y tolerancia al producto. Las enzimas se incubaron a 50 °C en tampón fosfato potásico (KPB) 10 mM (pH 7,5, que contenía ditiotreitol 0,5 mM) y se midió la actividad de cada NHasa cada diez minutos. Como se muestra en la Fig. 4a, los tiempos de vida media de NHase-(BA)P14K y NHase-(BAP14K) fueron respectivamente 2,8 y 2 veces más largos que los del tipo salvaje, lo que sugiere que NHase-(BA)P14K y NHase -(BAP14K) exhibe una termoestabilidad mayor que la de la NHase de tipo salvaje.

Comparación de propiedades de las NHasas de fusión con la NHase de tipo salvaje.

( a ) El análisis de la termoestabilidad, (b) tolerancia del producto y (c) pH óptimo de las NHasas de fusión y la NHase de tipo salvaje.

Además de la termoestabilidad, la alta acumulación del producto es beneficiosa para la producción industrial a gran escala, lo que conduce a ahorros de energía y simplificación del proceso posterior19. Para comparar la tolerancia de una amida de alta concentración de tipo salvaje y las enzimas de fusión, utilizamos nicotinamida para probar la tolerancia al producto de las NHasas. La reacción se llevó a cabo en 3-cianopiridina (sustrato) 20 mM con y sin nicotinamida (producto) 0,5 M durante 10 minutos. Se midió la reducción de 3-cianopiridina en cada reacción (Fig. 4b) y se calculó la relación de reducción (la proporción de la cantidad reducida de 3-cianopiridina en la reacción con y sin nicotinamida 0,5 M). Las proporciones de reducción de NHase-(BA)P14K y NHase-(BAP14K) fueron 0,86 y 0,83, respectivamente, que fueron superiores a las del tipo salvaje (0,80), lo que indica que las NHasas de fusión exhibieron una mayor tolerancia al producto que las del tipo salvaje. tipo.

Los valores de pH fisiológicamente óptimos de la mayoría de las NHasas varían entre 6,5 y 8,5 y la NHasa de P. putida tiene un amplio máximo de actividad entre pH 7,2 y 7,826. Se midió el pH óptimo de las NHasas de fusión y se comparó con el tipo salvaje. Como se muestra en la Fig. 4c, el pH óptimo del tipo salvaje, NHase-(BA)P14K y NHase-(BAP14K) fue 7,5, 8,0 y 7,5, respectivamente. Aunque la NHase-(BAP14K) mostró un rango estable similar al del tipo salvaje, el rango estable de la NHase-(BA)P14K fue más amplio, de 6,5 a 9,0, lo que sugiere que esta fusión podría ampliar el alcance del pH adecuado de la NHase. .

P14K es necesaria para la incorporación de cobalto a la NHasa de P. putida12. P14K forma un complejo α(P14K)2 con la subunidad α de la NHasa. Se confirma que la incorporación de cobalto en la NHase depende de la sustitución de la subunidad α entre la α(P14K)2 que contiene cobalto y la apo-NHase, lo que da como resultado la formación de NHase12 funcional. P14K también fue necesaria para la incorporación de cobalto en las NHasas de fusión (Tabla 1). Aquí, estudiamos si α(P14K)2 podría activar las NHasas de fusión. El α (P14K) 2 que contiene cobalto purificado se obtuvo agregando una etiqueta Strep delante de P14K como se describió anteriormente (Fig. 1a). Las NHas de fusión sin cobalto [apo-NHase-(BA), apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-(BAP14K)] se purificaron del cultivo en ausencia de cobalto. La NHasa apo-tipo salvaje también se purificó y se utilizó como control. La apo NHase de tipo salvaje, la apo-NHase-(BA), la apo-NHase-(BA)P14K y la apo-NHase-(BAP14K) purificadas se mezclaron respectivamente con la α(P14K)2 purificada que contenía cobalto y luego se incubaron. . La actividad NHasa en todas las mezclas aumentó a medida que aumentó el tiempo de incubación y la actividad más alta de las NHasas de fusión se observó en 1 hora. Luego se purificó cada NHasa resultante [R-NHase de tipo salvaje, R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K)] de las mezclas y se analizó. La actividad NHase de la NHase de tipo salvaje R fue similar a la de la NHase de tipo salvaje, lo que concuerda con los principios del intercambio de autosubunidades informados anteriormente12. Curiosamente, las actividades NHase de R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) fueron 240,5 y 219,2 U/mg, respectivamente, que eran aproximadamente el 50% de las NHasas de fusión que contienen cobalto correspondientes. La R-NHasa-(BA) también mostró una actividad del 30% (147,2 U/mg) de las NHasas de fusión que contienen cobalto (Tabla 1).

El ion cobalto es necesario para la actividad NHase. Las apo-NHasas de fusión fueron activadas por α(P14K)2. Estos resultados indican que el ion cobalto se transfirió de α(P14K)2 a las apo-NHasas de fusión. Para confirmar la transferencia de cobalto entre α (P14K) 2 y las apo-NHasas de fusión, se realizaron análisis de espectros de absorción UV-Vis. Como se muestra en la Fig. 3, todas las enzimas resultantes exhibieron un hombro adicional en la región de 300 a 350 nm (Fig. 3b) similar a los de las NHasas (NHasas que contienen cobalto) (Fig. 3c), mientras que las No se detectó hombro adicional en las apo-NHasas (Fig. 3d). Estos hallazgos sugirieron que R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) eran enzimas que contenían cobalto. El contenido de cobalto se determinó, como se muestra en la Tabla 1. R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) contenían respectivamente 0,23 mol de ion/mol (βα), 0,61 mol de ion /mol (βα) y 0,62 mol ion/mol (βαP14K). Por el contrario, también mezclamos apo-NHase, apo-NHase-(BA), apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-(BAP14K) con ion cobalto y los incubamos. No se detectó actividad significativa en estas mezclas (datos no mostrados), lo que indica que las NHas de fusión no se pudieron activar mezclándolas con ion cobalto in vitro, incluso para la apo-NHase-(BAP14K), que contenía el fragmento de P14K.

La unión de iones metálicos es responsable de la modificación postraduccional de las dos cisteínas en la subunidad α de NHase3,26. Sin embargo, tales modificaciones no pudieron observarse en apo-NHase26. Estos resultados nos permitieron especular que los residuos de cisteína se modifican en la NHase de fusión que contiene cobalto, pero no en la apo-NHase. Para aclarar el estado de oxidación de cisteína del sitio activo antes y después de la inserción de cobalto, analizamos apo-NHase-(BA)P14K, apo-NHase-(BAP14K), R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) por NanoLC-ESI-MS/MS. Las enzimas se trataron con tripsina después de reducción y carboxamidometilación. Se midió la masa molecular del péptido hidrolizado de tripsina que contiene todos los residuos de ligando metálico V351CTLCSCYPWPTLGLPPAWYK371 (VK21). En el espectro de masas del digesto tríptico de apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-(BAP14K) (Fig. 5a,c, interior), encontramos que el pico de masa con m/z 1286,15 y 1285,95 correspondía respectivamente al valor m/z del ion [M+2H]2+ de VK21 con tres carboxamidometil (CAM-) cisteína (el valor m/z calculado fue 1285,94). Sin embargo, en el espectro de masas del digesto tríptico de R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) (Fig. 5b,d, interior), encontramos que el pico de mayor masa con m/z 1272,83 y 1272,82 correspondieron respectivamente al valor m/z del ion [M+2H]2+ de VK21 con un Cys-SO2H y dos CAM-cisteína (el valor m/z calculado fue 1273,44). Para identificar los residuos modificados, realizamos una secuenciación MS/MS de los iones con m/z 1286,15, 1272,83, 1285,95 y 1272,82. Los espectros coincidieron con el patrón de fragmentación predicho de VK21 con Cys355-SO2H en R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) y CAM-Cys355 en apo-NHase-(BA)P14K y apo- NHase-(BAP14K). Aunque la aparición de la modificación Cys-SOH no se ha confirmado debido a su inestabilidad química27, estos resultados sugieren fuertemente que los residuos de cisteína oxidados existen en las dos NHasas de fusión después de la inserción de cobalto.

Identificación de Cys355-SO2H mediante análisis MS/MS.

Cada ion doblemente cargado correspondiente al péptido VK21 de (a) apo-NHase-(BA)P14K, (b) R-NHase-(BA)P14K, (c) apo-NHase-(BAP14K), (d) R- La NHase-(BAP14K) se analizó mediante un sistema NanoLC-ESI-MS/MS. Los picos de masa con m/z 1286,15 y 1285,95 correspondientes al ion [M+2H]2+ del péptido VK21 con tres CAM-cisteína (el valor m/z calculado fue 1285,94) se mostraron dentro de (a,c); los picos de masa con m/z 1272,83, 1272,82 corresponden al ion [M+2H]2+ del péptido VK21 con un Cys-SO2H y dos CAM-cisteína (el valor m/z calculado fue 1273,44) se muestran dentro de b, d. Los iones de los fragmentos N- y C-terminales en un enlace peptídico están etiquetados respectivamente en la figura como by y. Los iones b5 y b4 indicaron claramente que Cys355 se oxidó al ácido sulfínico en R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K), pero no en apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-( BAP14K). b* significa ion tipo b después de la desaminación e y* significa ion tipo y después de la desaminación.

Se ha confirmado que la incorporación de cobalto a la NHase de P. putida depende del intercambio de subunidades α entre la subunidad α libre de cobalto de la apo-NHase y la subunidad α que contiene cobalto de α(P14K)212. (Figura 6a). Para las NHas de fusión, P14K también era necesaria para la activación de las NHas de fusión y se encontró que el ion cobalto se transfirió de α (P14K) 2 a las NHas de fusión in vitro (Tabla 1). Es poco probable que se produzca un intercambio de subunidades α entre las NHasas de fusión y α(P14K)2 porque la subunidad α está fusionada con la subunidad β como un polipéptido en la NHasa de fusión. Por lo tanto, es probable que el ion cobalto en la subunidad α de α (P14K) 2 se haya transferido directamente al dominio de la subunidad α de las NHasas de fusión. En este proceso, α(P14K)2 probablemente actuó como metalochaperona para la transferencia de iones cobalto. El ion cobalto se transfirió entre las mismas dos subunidades α.

Mecanismo propuesto de incorporación de cobalto a la fusión NHase.

( a ) Intercambio de autosubunidades para la incorporación de cobalto en la NHase de tipo salvaje. ( b ) Transferencia de cobalto de α (P14K) 2 a apo-NHasa- (BA) P14K in vitro. La subunidad apo α en apo-NHase-(BA)P14K se acerca y se une al sitio de reconocimiento (unión) de P14K durante el intercambio de autosubunidad11 y luego la subunidad β (de apo-NHase-(BA)P14K) y la La subunidad α que contiene cobalto (de α(P14K)2) se atrae a través de la interacción electrostática y se asocia entre sí para formar un complejo intermedio. En lugar del intercambio de subunidades α entre las dos proteínas, se produce una transferencia directa de iones cobalto. La oxidación de las dos cisteínas es responsable de la unión del cobalto, lo que da como resultado la NHase-(BA)P14K activa. (c) Incorporación de cobalto en la fusión apo-NHase-(BA)P14K in vivo. P14K entra en contacto directamente con el dominio de la subunidad α de la proteína βα de fusión porque los sitios de unión en la subunidad α están libres debido a la fusión, lo que resulta en un complejo intermedio para la inserción de cobalto y la oxidación de dos cisteínas. En estos modelos, se usa una proteína de fusión βα para mostrar la apo-NHase-(BA)P14K, el cambio de ubicación de las dos argininas se usa para demostrar un mayor plegamiento después de la incorporación de cobalto.

Los iones metálicos tanto en Fe-NHase como en Co-NHase están ubicados en sus subunidades α, que comparten un motivo de unión metálico característico (CXLC(SO2H)SC(SOH)) que contiene dos residuos de cisteína oxidados: ácido cisteína-sulfínico (Cys-SO2H ) y ácido cisteína-sulfénico (Cys-SOH)4,28,29,30. Los residuos de cisteína oxidados son esenciales para la actividad NHasa9,31, lo que indica que los dos residuos de cisteína en las NHasas de fusión deben oxidarse. Se encuentra que los dos residuos de cisteína oxidados correspondientes existen en la subunidad α de αe2 (el complejo utilizado para el intercambio de autosubunidades de L-NHases en R. rhodochrous J1)9, lo que sugiere que los dos residuos de cisteína en α(P14K) 2 deben estar oxidados. Las metalochaperonas son proteínas de unión a metales diseñadas para entregar el ion metálico o cofactor metálico apropiado a sus objetivos altamente específicos3. El ion metálico o cofactor metálico generalmente se transfiere entre dos proteínas diferentes y la transferencia depende de la especificidad y afinidad del ligando por el ion metálico o cofactor metálico, como la metalochaperona de cobre que transfiere iones de cobre a ATPasa y superóxido dismutasa32,33,34,35 y metalochaperonas de níquel que transfieren iones de níquel a ureasa e hidrogenasa36,37,38. Durante estos procesos, las metalochaperonas de cobre son completamente diferentes a la ATPasa y la superóxido dismutasa y las metalochaperonas de níquel son completamente diferentes a la ureasa y la hidrogenasa; las proteínas objetivo deben exhibir una mayor especificidad y afinidad del ligando que las metalochaperonas. Sin embargo, aunque α(P14K)2 y NHasa son dos proteínas diferentes, las subunidades α en α(P14K)2 y en la NHasa de fusión tienen la misma secuencia de aminoácidos y deberían tener los mismos ligandos de iones cobalto. Por lo tanto, descubrimos un patrón de transferencia de iones metálicos para la biosíntesis de metaloproteínas, en el que un ión metálico se transporta entre las mismas subunidades proteicas en diferentes complejos proteicos.

Es misterioso que el ion cobalto se transfiera dentro de la misma proteína con el mismo entorno de ligando. Este fenómeno puede estar relacionado con la estructura del sitio activo de NHase. Los Cys-SO2H y Cys-SOH oxidados postraduccionalmente tienen estructuras Cys-SO2- y Cys-SO- desprotonadas, respectivamente, y los Cys-SO2- y Cys-SO- desprotonados en la subunidad α forman puentes salinos con dos arginina de la subunidad β de la NHasa (Fig. S2) 9. Sólo se necesita la fuerza electrostática para que la sal desencadene el intercambio de autosubunidades9. Los puentes salinos correspondientes no deberían existir en α (P14K) 2 porque P14K es más corto que la subunidad β y carece de la arginina correspondiente (Fig. S3). Los puentes salinos probablemente influyeron en el entorno del ligando del ion cobalto, lo que resultó en una mayor afinidad por el ion cobalto. Por lo tanto, cuando α(P14K)2 se mezcla con las NHas de fusión, el ion cobalto se transfiere de la subunidad α de α(P14K)2 al dominio de la subunidad α de las NHas de fusión. El proceso de transferencia de cobalto está asociado con la oxidación de cisteína debido a la función de oxidación de cisteína de la chaperona de intercambio de autosubunidades9. Un proceso de este tipo se muestra en la Fig. 6b.

Mientras que la apo-NHase-(BA)P14K fue activada por α(P14K)2 hasta el 50% de las NHasas de fusión, la apo-NHase-(BA) se activó solo hasta el 30% de la actividad (Tabla 1). Estos hallazgos indican que la estructura de apo-NHase-(BA)P14K podría ser diferente de la de apo-NHase-(BA) y que la apo-NHase-(BA)P14K es más adecuada para la incorporación de cobalto por α(P14K)2. . La diferencia entre apo-NHase-(BA) y apo-NHase-(BA)P14K está en la presencia o ausencia del gen P14K, lo que indica que la proteína P14K afecta la estructura de fusión NHase y podemos especular que P14K probablemente también actúe como un chaperona molecular para el plegamiento de NHasa.

Aunque el ion cobalto se transfirió de α(P14K)2 a las NHasas de fusión in vitro (Tabla 1), este proceso no debería existir in vivo porque α(P14K)2 no se puede formar en una célula porque los β- y α- Las subunidades se fusionan en una proteína. Debido a que P14K es necesaria para activar la expresión de la NHase de fusión y actúa como chaperona molecular para el plegamiento de la NHase, propusimos un proceso postraduccional para la NHase-(BA)P14K in vivo. Como se muestra en la Fig. 6c, después de la traducción de los genes BA y P14K, P14K entra en contacto con el dominio de la subunidad α de la proteína βα de fusión y se inserta un ion cobalto en el dominio de la subunidad α con la ayuda de P14K. El plegamiento de proteínas se produce con la ayuda de P14K después de la incorporación de cobalto, lo que da como resultado la formación de NHasa de fusión funcional. P14K se disocia de la fusión NHasa durante el proceso postraduccional25. En este proceso, P14K probablemente actúa como una chaperona molecular específica de apoproteína3 para la incorporación de cobalto en las NHasas de fusión, como GroEL, Hsp70 y Hsp40, que se unen y previenen el plegamiento incorrecto o estimulan el replegamiento de una amplia gama de proteínas39.

Debido a que P14K se pone en contacto primero con el dominio de la subunidad α de la proteína βα fusionada para la incorporación de cobalto en las NHasas de fusión, surge la pregunta de por qué este proceso no podría ocurrir en la NHase de tipo salvaje. P14K y otras chaperonas de intercambio de autosubunidades exhiben una similitud de secuencia significativa con la subunidad β de NHase correspondiente (aproximadamente 30% de homología) (Fig. S3) y ambas se conectan con la subunidad α. La subunidad β y P14K podrían tener los mismos sitios de unión en la subunidad α. Durante el proceso postraduccional de la NHase de tipo salvaje se produce una competencia por la unión de la subunidad α. Como resultado, se forman tanto apo-NHase como α(P14K)2, seguido del intercambio de autosubunidades para la biosíntesis de NHase. En este caso, P14K no pudo unirse a βα, porque los sitios de unión de la subunidad α están ocupados por la subunidad β. Para la NHase-(BA)P14K, la subunidad β se fusiona con la subunidad α y los sitios de unión de la subunidad α quedan libres. Por lo tanto, P14K se une directamente a los sitios de unión de la subunidad α de la fusión βα para la incorporación de cobalto.

Hemos descubierto que la incorporación de cobalto en la mayoría de las Co-NHasas depende del intercambio de autosubunidades tanto in vitro como in vivo9,11, mientras que el ion cobalto en la subunidad α de α(P14K)2 se transfiere directamente a la Dominio de la subunidad α de las NHasas de fusión en lugar de intercambio de autosubunidades in vitro (Tabla 1). Por lo tanto, surge otra pregunta: por qué no pudo ocurrir la transferencia directa durante la biosíntesis de la NHase de tipo salvaje. Es posible que ambos mecanismos ocurran en el proceso de biosíntesis de NHase de tipo salvaje; el mecanismo anterior sería el intercambio de autosubunidades. La unión del cobalto con la subunidad α es más estrecha que la unión de la chaperona de intercambio de autosubunidad con la subunidad α, por lo que el intercambio de la subunidad α es más fácil que la transferencia directa del cobalto. Por lo tanto, aunque ambos mecanismos ocurren en el proceso de biosíntesis de NHasa de tipo salvaje, el intercambio de autosubunidades podría ocurrir antes de la transferencia directa de cobalto. El mecanismo de reserva de la transferencia directa de cobalto puede tener una función parcial para la incorporación de cobalto. Como resultado, la apo-NHase-(BA)P14K y la apo-NHase-(BAP14K) se activan solo parcialmente por α(P14K)2 (Tabla 1). Además, la chaperona de intercambio de autosubunidad juega un papel importante en la incorporación del ion cobalto en la subunidad α. Se ha informado que la flexibilidad del dominio C terminal de P14K es uno de los factores clave para la incorporación de cobalto en la subunidad α40; La fusión NHases codificada por los genes BP14KA y P14KBA afectaría la flexibilidad del dominio C terminal de P14K porque hay una subunidad α o β ubicada en el dominio C terminal de P14K, lo que reduce la flexibilidad. Esta puede ser una de las razones por las que las dos NHasas de fusión exhibieron una menor actividad.

La fusión genética obliga sustancialmente a un par de proteínas a interactuar permanentemente entre sí y el evento de fusión tiende a optimizar el ensamblaje simplificando las topologías de los complejos proteicos23. Aquí, a través de una estrategia de fusión de genes, construimos dos NHasas de fusión con propiedades superiores. El mecanismo de incorporación de cobalto se alteró junto con esta evolución molecular in vivo y descubrimos un patrón de transferencia de iones metálicos que ocurre entre las mismas proteínas in vitro, lo que reveló un comportamiento inesperado de una metalochaperona. El mecanismo de incorporación de cobalto a NHase es fantástico y variable y los detalles deberían investigarse más a fondo.

El gen ABP14K que codifica la NHasa de tipo salvaje de P. putida se obtuvo de P. putida12. Se usaron los plásmidos pET-24a (+) y pET-28a (+) como vectores y se usó E. coli BL21 (DE3) para la sobreexpresión.

Los cebadores de oligonucleótidos utilizados en este estudio se muestran en la Tabla S1. Se usó el plásmido pET24a-BAP14K como plantilla y se diseñaron los cebadores B-Nde I-up y P-Hind III-down para la introducción de los sitios de restricción Nde I y Hind III, respectivamente. El fragmento de ADN amplificado se purificó usando un kit de purificación por PCR (Promega) y se digirió con Nde I y Hind III, se ligó en los sitios Nde I y Hind III de pET-28a (+), luego se transformó en E. coli JM109 y se secuenció. Si la secuencia era correcta, el extracto de plásmido de E. coli JM109 se transformó en E. coli BL21 (DE3). Los plásmidos recombinantes (pET28a-(BA)P14K y pET28a-(BAP14K)) se construyeron mediante un protocolo de PCR de extensión superpuesta basado en pET28a-BAP14K. Para construir pET28a-(BA)P14K y pET28a-(BAP14K), se usaron pares de cebadores Linker1-up y Linker1-down para conectar las subunidades β y α y Linker2-up y Linker2-down para conectar α- y Subunidades P14K. A continuación, se construyó pET28a-(BA) con los pares de cebadores B-Nde I-arriba y A-Hind III-abajo amplificando (BA) de pET28a-(BA)P14K y el producto de PCR y pET-28a (+) fueron ambos. digerido con Nde I y Hind III después de 4 horas. Después se ligó el fragmento de ADN purificado en los sitios Nde I y Hind III de pET-28a (+). Los plásmidos recombinantes (pET28a-(BP14KA) y pET28a-(P14KBA)) se construyeron respectivamente mediante un protocolo de PCR de extensión superpuesta basado en pET28a-(BA) con el producto de PCR P14K-1 y P14K-2 como cebadores. El producto de PCR P14K-1 se amplificó con los pares de cebadores B(P)A-up y B(P)A-down y P14K-2 se amplificó con los pares de cebadores (P)BA-up y (P)BA-down con el pET24a-BAP14K como plantilla.

La E. coli recombinante para la expresión de la enzima se cultivó primero en 10 ml de medio líquido 2YT que contenía 50 µg/ml de kanamicina a 37°C, luego se cultivó en 500 ml de medio líquido 2YT en un matraz de 2 litros que contenía 50 µg/ml. kanamicina a 37°C con agitación a 200 rpm. Cuando la densidad óptica a 600 nm (DO600) del cultivo alcanzó 0,8, se añadió isopropil β-D-1-tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de NHase y se añadió CoCl2.6H2O a una concentración final. de 0,05 g/l para obtener NHasa madura. Posteriormente el cultivo se incubó a 24°C durante 16 h.

Todos los pasos de purificación se realizaron a 0–4 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 6000 x g durante 15 minutos, se resuspendieron en KPB 10 mM (que contenía ditiotreitol 0,5 mM, pH 7,4) y se lisaron mediante sonicación en hielo. Los sobrenadantes se eliminaron mediante centrifugación a 15.000 xg durante 15 minutos y se filtraron a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm. Para la purificación de proteínas sin ninguna etiqueta, se utilizó una columna DEAE-Sephacel (3 x 5 ml) (GE Healthcare UK Ltd.). Primero, la columna se equilibró con KPB 10 mM y la proteína se eluyó con un gradiente lineal de KCl de 0 a 0,5 M en KPB. Las fracciones activas se recogieron, se concentraron hasta 1 ml mediante ultrafiltración y se aplicaron a una columna SuperdexTM 200 10/300 GL (GE Healthcare UK Ltd.) y se equilibraron con KPB 10 mM, con un caudal de 0,5 ml/min. Para la purificación de enzimas marcadas con His, el filtrado se aplicó a una columna de cromatografía HisTrap HP (GE Healthcare) utilizando un purificador AKTA (GE Healthcare, Houston, TX). La columna se equilibró con tampón A (tampón fosfato 50 mM, NaCl 0,3 M e imidazol 20 mM, pH 7,4) y las proteínas unidas se eluyeron con tampón B (tampón fosfato 50 mM, NaCl 0,3 M e imidazol 500 mM, pH 7,4). . Asimismo, para la purificación de enzimas marcadas con Strep, se equilibró una columna StrepTrap HP (GE Healthcare UK Ltd.) con tampón de unión (Na2HPO4 · 12H2O 20 mM, NaCl 280 mM, KCl 6 mM, pH 7,4). Después de inyectar el sobrenadante en la columna e incubar durante media hora, eluimos las proteínas con tampón de elución (tampón de unión que contiene destiobiotina 25 mM, pH 7,4). Se recogieron las fracciones activas y el siguiente paso de filtración en gel fue el mismo que se mencionó anteriormente. Las proteínas purificadas se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y la concentración de proteínas se cuantificó mediante el método de Bradford41.

Para determinar las masas moleculares y las estructuras de NHasas, las enzimas purificadas y las proteínas marcadoras se aplicaron a una columna SuperdexTM 200 10/300 GL (GE Healthcare UK Ltd.). Las masas moleculares se calcularon a partir de la curva estándar de proteínas marcadoras mediante extrapolación. Las estructuras de las enzimas se especularon a partir de las masas moleculares.

La actividad NHasa se midió mediante el aumento de producto. La mezcla de reacción (0,5 ml) contenía KPB 10 mM (pH 7,4), 3-cianopiridina 200 mM y 10 µl de la cantidad apropiada de la solución enzimática. La reacción se realizó a 25°C durante 10 min y se detuvo con la adición de 0,5 ml de acetonitrilo. La cantidad de producto formado se determinó midiendo la absorbancia a 215 nm y extrapolando a partir de una curva estándar. Una unidad (U) de actividad NHase se define como la cantidad de enzima que liberó 1 μmol de nicotinamida por minuto en estas condiciones de ensayo.

Las enzimas purificadas (0,5 mg/ml) se analizaron con un espectrofotómetro de absorción atómica Shimadzu AA-7000 en las siguientes condiciones: longitud de onda, 240,73 nm; corriente de lámpara, 12 mA; y ancho de hendidura, 0,2 nm. La cantidad de ion cobalto en las enzimas purificadas se calculó mediante extrapolación a partir de una curva estándar.

Los espectros UV-V se obtuvieron con un espectrofotómetro U-3900 (Hitachi, Tokio, Japón) a temperatura ambiente. Se dializaron enzimas frente a KPB 10 mM (pH 7,5) y se prepararon muestras de 1,0 mg/ml.

Los parámetros cinéticos (Km, Vmax, kcat) de BAP14K y las proteínas de fusión se determinaron en KPB 10 mM a 25 °C y la concentración de enzimas fue de 0,2 mg/ml. Las concentraciones de 3-cianopiridina fueron 10, 20, 50, 100 y 200 mM y la reacción se terminó con acetonitrilo después de 2 minutos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software Graphpad Prism 5.

Para determinar la estabilidad térmica, incubamos las enzimas purificadas a 50°C durante 40 minutos y medimos su actividad cada diez minutos. El método de determinación de la actividad fue el mencionado anteriormente.

La tolerancia del producto estuvo representada por la disminución de 3-cianopiridina en presencia de nicotinamida 0,5 M y sin nicotinamida se utilizó como control. Para comparar la tolerancia al producto de las recombinasas, determinamos la reducción de 3-cianopiridina en las mezclas con y sin nicotinamida.

El pH óptimo para la actividad enzimática se determinó realizando el ensayo en tampones de pH (KH2PO4, 3,893 g/l; C6H8O7·H2O, 6,008 g/l; H2BO3, 1,769 g/l; y Barbital-Na2, 5,266) (pH de 6,0 a 11.0). El pH con mayor actividad se definió como el pH óptimo y la mayor actividad se tomó como 100%.

Los espectros de dicroísmo circular (CD) se recogieron utilizando un MOS-450/AF-CD-STP-A (Bio-Logic, Grenoble, Francia) con una cubeta de cuarzo de 1 cm de longitud de paso a una concentración de proteína de 0,2 mg/ml en KPB de 10 mm. El espectropolarímetro y la lámpara de xenón se calentaron durante 30 minutos antes de los experimentos. Medimos la elipticidad entre 190 y 250 nm y se restó el espectro de un blanco de tampón. Utilizamos un método en línea K2D3 en un servidor web de acceso público en http://k2d3.ogic.ca/ para predecir los tipos de estructuras secundarias. Este método mejora las predicciones, particularmente para el intervalo de longitud de onda entre 200 y 240 nm y para el contenido de la cadena beta42.

En un estudio anterior, el activador P14K podría existir con la subunidad α en forma de heterotrímero α(P14K)2 y podría existir de manera estable cuando se agregó una etiqueta Strep al N-terminal de P14K12. Como resultado, utilizamos pET24a-StrepP14K para preparar α(StrepP14K)2. La apoproteína se cultivó en ausencia de cobalto. Por el contrario, la proteína que contiene cobalto se cultivó en presencia de cobalto. La apo-NHasa purificada (0,1 mg/ml) se mezcló con α(StrepP14K)2 purificada que contenía cobalto (0,8 mg/ml) seguido de incubación en KPB 10 mM (que contiene ditiotreitol 0,5 mM, pH 7,4) a 25°C. . Como control, la apo-NHasa purificada se mezcló con ion cobalto (20 µM) de la misma manera.

Se utilizó el espectrómetro de masas MALDI-TOF (ultrafleXtreme, Bruker Daltonics) para determinar la masa molecular de la subunidad fusionada. Los espectrómetros de masas MALDI-TOF introducidos recientemente permiten la adquisición de espectros de iones fragmentados de alta calidad de biomacromoléculas mediante fragmentación inducida por láser (LID). Primero se preparó la matriz (se diluyeron 7,6 mg de 2,5-dihidroxiacetofenona en 375 µl de etanol y se agregaron 125 µl de solución de dihidrógeno-citrato de amonio de 18 mg/ml) y se prepararon 2 µl de matriz, 2 µl de solución de TFA al 2% y 2 µl de muestra (5 mg/ml) se mezclaron. La solución de muestra se mezcló completamente usando puntas de pipeta hasta que se pudo observar la cristalización. La solución de muestra de 0,5 µl se secó y se secó sobre una placa objetivo de acero inoxidable pulido. La cuantificación de las señales de masa se realizó mediante el software FlexAnalysis.

El tratamiento de la muestra sigue un protocolo de uso común43. En resumen, la solución de muestra se desnaturalizó primero en urea 8 M, los enlaces disulfuro se redujeron con ditiotreitol y todos los residuos de cisteína se carboxamidometilaron con yodoacetamida. Luego, la muestra se limpió mediante diálisis y se digirió con TPCK-tripsina (Promega) en el tampón de digestión (bicarbonato de amonio 100 mM, pH 8,5). Los péptidos procedentes de la digestión se secaron completamente en un dispositivo SpeedVac (Thermo). Luego, la muestra seca se volvió a disolver en una solución de muestra (2 % de acetonitrilo, 0,5 % de ácido fórmico y 97,5 % de agua). Luego se analizó una muestra de péptido disuelto mediante un sistema NanoLC-ESI-MS/MS.

El análisis NanoLC-ESI-MS/MS de muestras de proteínas digeridas se llevó a cabo mediante un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Agilent) con una columna C18 de fase inversa de un diámetro interior de 75 micrómetros y 8 cm de longitud. El tiempo de inyección fue de 20 minutos. El disolvente A de HPLC era 97,5 % de agua, 2 % de acetonitrilo y 0,5 % de ácido fórmico y el disolvente B era 9,5 % de agua, 90 % de acetonitrilo y 0,5 % de ácido fórmico. El tiempo de gradación fue de 100 minutos desde 2% de Solvente B hasta 90% de Solvente B, más 20 minutos para la carga de la muestra y 20 minutos para el lavado de la columna. El caudal de la columna fue de aproximadamente 800 nanolitros por minuto después de la división. El volumen de inyección típico fue de 3 µl. El sistema de HPLC se acopló en línea con un espectrómetro de masas LTQ (Thermo) de manera que una muestra eluida de la columna de HPLC se ionizó directamente mediante un proceso de ionización por electropulverización (ESI) y se introdujo en el espectrómetro de masas. El voltaje de ionización se optimizó cada vez y normalmente en un rango de 1,2 kV a 1,8 kV.

Cómo citar este artículo: Xia, Y. et al. Construcción de una nitrilo hidratasa de fusión de subunidades y descubrimiento de un patrón innovador de transferencia de iones metálicos. Ciencia. Rep. 6, 19183; doi: 10.1038/srep19183 (2016).

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Este trabajo cuenta con el apoyo financiero del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de Alta Tecnología de China (Programa 863, 2014AA021304), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (JUSRP51411B), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31300087) y la Fundación de Ciencias Naturales. de Jiangsu (BK20130131, BK20130139), un proyecto financiado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu, el Proyecto 111 (No. 111-2-06), el “Centro de Innovación Colaborativa para la Fermentación Industrial Avanzada” de la provincia de Jiangsu para el desarrollo industrial programa.

Laboratorio Clave de Biotecnología Industrial, Ministerio de Educación, Escuela de Biotecnología, Universidad de Jiangnan, Wuxi, 214122, China

Yuanyuan Xia, Wenjing Cui, Zhongmei Liu, Li Zhou, Youtian Cui y Zhemin Zhou

Instituto de Bioquímica Aplicada y Escuela de Graduados en Ciencias de la Vida y el Medio Ambiente, Universidad de Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, 305-8572, Ibaraki, Japón

Michihiko Kobayashi

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YX, WC, realizó la purificación de proteínas. YX, WC, ZL, LZ e YC realizaron investigaciones enzimáticas in vitro e in vivo. YX, WC, XZ y RS, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. MK y ZZ dirigieron la investigación. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Xia, Y., Cui, W., Liu, Z. et al. Construcción de una nitrilo hidratasa de fusión de subunidades y descubrimiento de un patrón innovador de transferencia de iones metálicos. Informe científico 6, 19183 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19183

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Recibido: 14 de mayo de 2015

Aceptado: 07 de diciembre de 2015

Publicado: 12 de enero de 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep19183

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