El análisis de la acción de la hiperforina (hierba de San Juan) en el canal TRPC6 conduce al desarrollo de una nueva clase de fármacos antidepresivos

Molecular Psychiatry volumen 27, páginas 5070–5085 (2022)Cite este artículo

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La hierba de San Juan es una hierba que se utiliza desde hace mucho tiempo en la medicina popular para el tratamiento de la depresión leve. Su constituyente antidepresivo, la hiperforina, tiene propiedades como la inestabilidad química y la inducción de interacciones entre fármacos que impiden su uso para farmacoterapias individuales. Aquí identificamos el canal canónico de 6 receptores potenciales transitorios (TRPC6) como un objetivo farmacológico para controlar el comportamiento ansioso y depresivo y como un requisito para la acción antidepresiva de la hiperforina. Demostramos que la deficiencia de TRPC6 en ratones no solo produce un comportamiento ansioso y depresivo, sino que también reduce la excitabilidad de las neuronas piramidales CA1 del hipocampo y las células granulares del giro dentado. Utilizando electrofisiología y mutagénesis dirigida, mostramos que la hiperforina activa el canal a través de un motivo de unión específico en TRPC6. Realizamos un análisis de la acción de la hiperforina para desarrollar un nuevo fármaco antidepresivo que utiliza el mismo mecanismo objetivo TRPC6 para su acción antidepresiva. Sintetizamos el análogo de hiperforina Hyp13, que muestra una unión similar a TRPC6 y recapitula los efectos ansiolíticos y antidepresivos dependientes de TRPC6 en ratones. Hyp13 no activa el receptor X de embarazo (PXR) y, por lo tanto, pierde el potencial de inducir interacciones entre fármacos. Esto puede proporcionar un nuevo enfoque para desarrollar mejores tratamientos para la depresión, ya que la depresión sigue siendo uno de los trastornos mentales más resistentes al tratamiento, lo que justifica el desarrollo de fármacos eficaces basados ​​en compuestos naturales.

La depresión es un trastorno mental grave con una prevalencia a lo largo de la vida de más del 10% [1]. Además del estado de ánimo deprimido, se producen síntomas como pérdida de interés, anhedonia, ansiedad, sentimientos de inutilidad, pérdida de peso, insomnio y déficit de concentración [2, 3]. En la práctica médica diaria se utilizan varios antidepresivos diferentes, como los inhibidores selectivos de la captación de serotonina (ISRS) o los fármacos tricíclicos, para tratar a los pacientes deprimidos [2]. Sin embargo, los pacientes sufren varios efectos secundarios duraderos que reducen la adherencia, como aumento de peso o disfunción sexual, o muestran una respuesta parcial o nula a los antidepresivos clásicos.

Los pacientes con depresión leve a moderada prefieren los antidepresivos de origen vegetal, como la hierba de San Juan, debido a que tienen menos efectos secundarios que los antidepresivos sintéticos comúnmente recetados. El antidepresivo a base de hierbas hierba de San Juan se ha utilizado durante siglos para tratar la depresión leve a moderada [4,5,6]. La hiperforina, el principal componente antidepresivo, es un derivado de floroglucinol bicíclico acilado con pocas semejanzas estructurales y funcionales con cualquier antidepresivo conocido de uso terapéutico. El mecanismo de acción antidepresivo de la hiperforina está siendo objeto de intenso debate [7]. En sistemas de expresión heterólogos y células no neuronales, se ha propuesto que la hiperforina actúe como protonóforo en las membranas celulares internas y externas, impidiendo así la captación y el almacenamiento vesicular de diversos neurotransmisores, incluidas las monoaminas. Por el contrario, hemos demostrado que la hiperforina activa los canales del canal 6 del receptor potencial transitorio (TRPC6) y planteamos la hipótesis de que este efecto es esencial para su perfil antidepresivo [9, 10]. TRPC6 es miembro de la superfamilia TRP. Los canales TRP son homo y/o heterotetrámeros de subunidades que contienen seis segmentos transmembrana (S1-S6) y colas citoplásmicas N y C terminales [11]. S5, S6 y el bucle del poro conector forman el poro conductor de cationes. S1-S4 y los extremos citoplasmáticos N y C son importantes para la activación de canales y la interacción con ligandos o proteínas [12,13,14,15,16]. La subfamilia TRPC humana comprende siete miembros, TRPC1 a TRPC7 [15, 17]. Para diferentes canales TRPC, incluido TRPC6, se publicaron recientemente estructuras crio-EM, por ejemplo, [18,19,20]. Sin embargo, no se resolvieron regiones altamente flexibles en el extremo C que podrían contribuir a cambios conformacionales durante la activación [19,20,21,22]. Es importante destacar que la hiperforina solo activa los canales TRPC6 y no los canales TRPC3 y TRPC7, estrechamente relacionados [9].

Los canales TRPC6 se expresan en varias áreas del cerebro relevantes para la depresión, como la circunvolución dentada, donde la expresión del canal es particularmente prominente, así como en regiones corticales [23,24,25,26,27]. Nosotros y otros hemos demostrado que los canales TRPC6 están involucrados en cambios de plasticidad sináptica que van desde el crecimiento dendrítico, cambios en la morfología de la columna y el aumento de las sinapsis excitadoras [25, 28]. La hiperforina actúa como un mimético del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en las neuronas del hipocampo modificando la morfología de la columna dendrítica a través de los canales TRPC6 [24]. Sin embargo, la hiperforina no es estable cuando se expone a la luz y al oxígeno [29]. También induce interacciones fármaco-fármaco debido a la potente activación del receptor nuclear PXR (NR1I2), un regulador transcripcional clave de genes implicados en el metabolismo y transporte de fármacos [30]. Estas características limitan su aplicación clínica y requieren mayores desarrollos de antidepresivos terapéuticamente aplicables.

Utilizando una combinación de análisis de comportamiento, electrofisiología, mutagénesis dirigida y síntesis química, aquí demostramos que los ratones knockout (KO) para TRPC6 muestran un comportamiento depresivo y ansioso. Esto va acompañado de una actividad reducida de las células granulares en la circunvolución dentada y de las neuronas piramidales en la región CA1 del hipocampo como posible mecanismo depresógeno. Identificamos un tramo de aminoácidos dentro del extremo C citoplasmático esencial para la interacción directa de la hiperforina con TRPC6. Basándonos en estos conocimientos, sintetizamos el análogo de hiperforina Hyp13, que es un floroglucinol químicamente simplificado. Mostramos que Hyp13 tiene efectos antidepresivos que dependen de TRPC6. Además, Hyp13 no activa PXR ni induce CYP3A4. Nuestros hallazgos resaltan el papel crucial de los canales TRPC6 en la depresión y la ansiedad. Por lo tanto, sugerimos TRPC6 como un nuevo objetivo farmacológico para la terapia antidepresiva.

Para probar la participación de TRPC6 en la depresión y la ansiedad, utilizamos un modelo de ratón TRPC6 KO [31]. Los ratones macho TRPC6 KO muestran un comportamiento ansioso en la prueba de campo abierto y en la prueba de laberinto elevado. En la prueba de campo abierto, los ratones TRPC6 KO muestran una reducción significativa del tiempo central (Fig. 1A), un número reducido de tiempo de entradas al centro (Fig. 1B), una disminución de la locomoción central (Fig. 1C) y el tiempo de locomoción de la periferia (Fig. 1D) en comparación. a ratones de tipo salvaje (WT). En la prueba del laberinto elevado en cruz (EPM), los ratones TRPC6 KO pasan significativamente más tiempo en el brazo cerrado (CA) en comparación con los animales WT (Fig. 1E). La locomoción del brazo en el brazo cerrado y el centro del laberinto se reduce significativamente en los ratones TRPC6 KO (Fig. 1F). En la prueba de natación forzada (FST), los ratones TRPC6 KO se caracterizan por un tiempo de inmovilidad significativamente mayor (Fig. 1G). En la prueba de preferencia de sacarosa (SPT), que refleja anhedonia, los ratones TRPC6 KO muestran una preferencia de sacarosa reducida en comparación con el tiempo de los animales WT (Fig. 1H). En conjunto, estos hallazgos muestran un claro fenotipo depresivo/ansioso en ratones que carecen de TRPC6.

A–D Ensayo de comportamiento en campo abierto. E, F Comportamiento en la prueba del laberinto en cruz elevado (OA brazo abierto, CA brazo cerrado, Ctr centro). G Comportamiento en la prueba de nado forzado. H Prueba de preferencia de sacarosa. Los datos se expresan como medias ± sem (n = 14 por grupo; *p < 0,05, **/#P < 0,001, ***/$P < 0,001 frente a WT).

El hipocampo es una estructura clave para la regulación emocional que puede dar lugar a trastornos de depresión y ansiedad [32,33,34,35,36]. Para identificar un posible correlato neuronal para el comportamiento similar a la depresión y la ansiedad en ratones TRPC6 KO, investigamos la excitabilidad neuronal DG y CA1 en cortes agudos de hipocampo de ratones WT y KO utilizando grabaciones de pinza de corriente de células completas. Se observa un potencial de membrana en reposo (RMP) comparable en células piramidales WT y TPRC6 KO CA1 (WT, −72,9 ± 0,8 mV, n = 14 de 9 ratones; TRPC6-KO, −74,3 ± 0,9 mV, n = 18 de 6 ratones, p = 0,26) y células granulares DG (WT, −86,0 ± 0,5 mV, n = 25 de 15 ratones; TRPC6-KO, −86,3 ± 0,5 mV, n = 29 de 8 ratones, p = 0,70). En comparación con sus contrapartes WT, las células granulares TRPC6 KO tienen una menor resistencia de entrada a la membrana (RN; a −70 mV: WT, 325,0 ± 10,9 MΩ; TRPC6 KO, 288,9 ± 10,8 MΩ; p = 0,02), mientras que no hay una diferencia significativa entre Células piramidales WT y CA1 mutantes (WT, 194,1 ± 9,4 MΩ; TRPC6 KO, 204,4 ± 12,3 MΩ; p = 0,53). Para sondear las propiedades de activación celular, evocamos potenciales de acción (AP) con una rampa de corriente despolarizante (0–100 pA durante 2 s) a partir del RMP de las neuronas o, para una mejor comparación entre grupos, desde un potencial de membrana de −70 mV. que se ajusta mediante inyección de corriente. Como lo ilustran las trazas de voltaje representativas representadas en la Fig. 2A que se obtienen de una célula piramidal WT y TRPC6 KO CA1, la alteración genética de trpc6 reduce la propensión a disparar, de modo que se disparan menos AP por rampa de despolarización en comparación con la neurona WT. Tanto las células piramidales CA1 como las células granulares DG de ratones TRPC6 KO exhiben un patrón de descarga significativamente mitigado independientemente de si el disparo se provoca desde el reposo o desde -70 mV (Fig. 2B). Viceversa, reobase, la corriente mínima necesaria para inducir el primer AP durante la despolarización en rampa aumenta significativamente en las células granulares DG y las neuronas CA1 de ratones TRPC6 KO en comparación con ratones WT (Fig. 2C). Estos datos muestran que la pérdida constitutiva de la función TRPC6 genera alteraciones duraderas de las propiedades básicas de activación de las neuronas DG y CA1.

Se realizaron registros de pinzamiento de corriente de células completas a partir de células piramidales CA1 del hipocampo y células granulares del giro dentado en la preparación de cortes de cerebro. Los potenciales de acción (AP) se evocaron con un pulso de rampa despolarizante de 0 a 100 pA durante 2 s desde el potencial de membrana en reposo (RMP) o −70 mV (ajustado por inyección de corriente). A Los rastros de voltaje de las células piramidales CA de un WT y un corte TRPC6 KO ilustran los AP evocados. La línea discontinua indica −70 mV y las líneas grises a continuación muestran el protocolo de rampa. Los histogramas resumen el número de AP por rampa (B) y la reobase (la corriente mínima necesaria para provocar el primer AP; C en células del hipocampo WT y TRPC6 KO. *p <0,05; **p <0,01.

A continuación, examinamos el efecto de la hiperforina sobre la excitabilidad de las células granulares de DG y el papel de TRPC6 en ellas, utilizando el mismo protocolo de despolarización en rampa que el anterior. En las células granulares WT, la aplicación en baño de hiperforina (3 µM) produce una respuesta bifásica, donde un aumento transitorio en la excitabilidad es seguido por una fuerte inhibición de la activación de AP (Fig. 3A, trazos superiores, Fig. 3C, n = 8 de 7 ratones). ., La trayectoria correspondiente del potencial de membrana muestra una pequeña despolarización inicial y una hiperpolarización pronunciada posterior que dura más que el tiempo de aplicación del fármaco (Fig. 3B). Por el contrario, la hiperforina no logra excitar las neuronas deficientes en TRPC6, mientras que la acción inhibidora del fármaco no se ve afectada (Fig. 3A, trazos inferiores; Fig. 3C, n = 5 de 5 ratones). Para excluir un posible efecto sináptico de la hiperforina sobre la excitabilidad celular, aislamos funcionalmente las células registradas de las entradas excitadoras e inhibidoras en cortes WT con antagonistas de los receptores ionotrópicos de glutamato (ácido quinurénico; 2 mM) y receptores GABAA (picrotoxina, 100 µM). y observe respuestas bifásicas similares tras la aplicación de hiperforina (Fig. 3C, n = 6 de 4 ratones). Durante la fase excitatoria temprana, el RN aumenta de 240,0 ± 10,4 MΩ en condiciones de control a 257,8 ± 8,6 MΩ (p = 0,046), y luego cae a 160,5 ± 12,5 MΩ durante la fase inhibidora (n = 6 de 4 ratones, p = 0,002 ). A partir de estos hallazgos, resulta evidente que, en primer lugar, la hiperforina requiere la presencia de TRPC6 para excitar las células granulares y promover su activación y, en segundo lugar, que el efecto inhibidor retardado de la hiperforina no depende de la activación previa de TRPC6. Cuando se registró en células granulares WT cuyo voltaje se fijó a −70 mV en presencia de TTX (1 µM) para bloquear los AP, la hiperforina (3–10 µM) provoca una corriente entrante de −8,0 ± 1,4 pA (n = 10 de 6 ratones) que es seguida por una corriente de salida, mientras que en las células granulares deficientes en TRPC6, se anula la respuesta de la corriente de entrada a la hiperforina (Fig. 3D, n = 7 de 3 ratones). La corriente de salida inducida por hiperforina que está igualmente presente en las neuronas KO WT y TRPC6 probablemente esté mediada por canales de K+, ya que se reduce fuertemente cuando sustituimos K+ por Cs+ en la solución de la pipeta (n = 10 de 4 ratones wt; n = 6 de 3 ratones TRPC6 KO (Fig. 3E). La caracterización exacta de la corriente de salida y su posible implicación en la acción antidepresiva de la hiperforina aguarda más estudios. Sin embargo, se pueden sacar conclusiones firmes con respecto al controvertido mecanismo iónico de la corriente entrante mediada por hiperforina. Además de los canales TRPC6 [24], se ha propuesto que los canales aniónicos [37] y los canales de protones [8] den lugar a esta corriente. Nuestros datos ahora argumentan firmemente a favor del TRPC6. Además, sugieren que la activación farmacológica selectiva de TRPC6 podría ser un enfoque prometedor para corregir el patrón de activación aberrante de las neuronas del hipocampo asociado con un comportamiento similar a la depresión.

A – C El registro de pinza de corriente de células enteras de células granulares muestra los efectos de la hiperforina (3 µM) en los AP evocados (A, C) y en el potencial de membrana (B). Las líneas discontinuas indican −70 mV, la rampa de despolarización fue de 0 a 70 pA para las células granulares WT y de 0 a 100 pA para las células TRPC6 KO. La respuesta bifásica inducida por hiperforina en cortes de peso se conservó después de bloquear la transmisión sináptica rápida con ácido quinurénico (KA) y picrotoxina (PTX) (C). D, E Las grabaciones de pinza de voltaje (mantenidas a −70 mV) ilustran la pérdida de corriente entrante inicial inducida por hiperforina en neuronas de ratones TRPC6 KO (D). La corriente de salida restante involucra canales de K+, como lo indica la pérdida de corriente con la pipeta llena de CsGlu (E). ***p < 0,001.

Después de demostrar que la corriente entrante iniciada por hiperforina se pierde en ratones TRPC6 KO, preguntamos si la hiperforina se une directamente a TRPC6. Anteriormente demostramos que la hiperforina solo activa los canales humanos TRPC6 (hTRPC6) (modelo de topología, Fig. 4A), pero no muestra ningún efecto estimulante sobre los canales filogenéticamente estrechamente relacionados hTRPC3 y hTRPC7 en el mismo subgrupo o, de hecho, sobre cualquier otro canal hTRPC [9]. Para aprovechar esto para la identificación de aminoácidos relevantes para la activación de TRPC6 dependiente de hiperforina, mutamos residuos que difieren entre hTRPC6 y hTRPC3/TRPC7 (Suplemento 1, alineación de secuencia) [3]. Estas proteínas hTRPC6 mutantes se expresan en células HEK293 como proteínas de fusión YFP C-terminales para controlar la expresión y la localización celular. La expresión de proteínas se verifica mediante análisis de transferencia Western y microscopía de fluorescencia, lo que demuestra que no se encuentran diferencias entre hTRPC6 y TRPC6 mutado (Figura complementaria 2). Para probar la funcionalidad, se realizan mediciones de calcio unicelular utilizando el tinte fluorescente fura-2 aplicando OAG o SAG, análogos del diacilglicerol activador endógeno no selectivo TRPC3/6/7 [38]. Para experimentos de imágenes de calcio utilizamos OAG (100 m) y lo aplicamos antes de la aplicación de hiperforina (10 m). En las células que expresan TRPC6, la aplicación de OAG provoca un rápido aumento de [Ca2+]i reflejado por un aumento de la proporción fura-2. La aplicación posterior de hiperforina produce una respuesta con un aumento comparable de [Ca2+]i. Para ver si los mutantes TRPC6 reaccionan de manera diferente a la hiperforina, también se estimulan con OAG (100 m) e hiperforina (10 m) (consulte la alineación del Suplemento 1 con todos los mutantes investigados). Es importante destacar que identificamos un mutante TRPC6 que todavía mostraba un aumento rápido inducido por OAG (100 µM) en la proporción de fura-2 pero no reacciona a la hiperforina (10 µM) (Fig. 4B, D). Aquí, los aminoácidos 777LLKL780 en la región C-terminal de hTRPC6 se reemplazan por los aminoácidos correspondientes 708IMRI711 de hTRPC3 y hTRPC7 (722IMRI725) (modelo de topología, Fig. 4A).

A El modelo de topología del TRPC6 humano (hTRPC6) muestra hélices α en cilindros y las líneas discontinuas describen una región con densidad insuficiente en la estructura CryoEM PDB: 6uz8. El sitio potencial de unión de hiperforina está marcado con una estrella roja. B Bosquejo que demuestra que los aminoácidos LLKL se mutaron en hTRPC6 en los respectivos aminoácidos IMRI de hTRPC3 para bloquear la activación de TRPC6 mediada por hiperforina. En un segundo paso, los aminoácidos IMRI en hTRPC3 se mutaron en los aminoácidos LLKL correspondientes de hTRPC3 para inducir un canal hTRPC3 sensible a hiperforina. hTRPC6 (negro), TRPC6mut = IMRITRPC6mut (rojo), hTRPC3 (gris), TRPC3mut = LLKLTRPC3mut. C Se realizaron imágenes de Ca2+ unicelulares en células HEK293 que expresan transitoriamente el vector plásmido pcDNA3.1 con ADN que codifica solo para eYFP (ctl, blanco), hTRPC6 (negro), hTRPC6mut (rojo), hTRPC3 (gris) o hTRPC3mut (azul) todos expresados ​​como proteínas de fusión eYFP C-terminales. Las células se estimularon con el disolvente DMSO (0,1%), OAG (100 µM) o hiperforina (10 µM) y las alteraciones de Ca2+ intracelular se detectaron utilizando fura-2 AM (n = 7–9 ± SEM, las células se seleccionaron según su eYFP fluorescencia y su sensibilidad a OAG; la significación estadística se analizó mediante ANOVA con la prueba de Dunnett post hoc ***p < 0,001) C Se registraron corrientes de células enteras a partir de células HEK293 que expresaban transitoriamente eYFP (ctl, blanco), hTRPC6 (negro), hTRPC6mut ( rojo), hTRPC3 (gris) o hTRPC3mut (azul), todos expresados ​​como proteínas de fusión eYFP C-terminales. La densidad de corriente media se representa a +100 y −100 mV después de la aplicación de hiperforina (10 µM). Las corrientes se normalizaron a las corrientes básicas antes de restar la aplicación del compuesto (n = 3 ± SEM¸. La significación estadística se analizó mediante ANOVA con la prueba de Dunnett post hoc ***p < 0,001). D Se monitorearon trazas de tiempo representativas en células HEK293 ctl (línea discontinua), células HEK293 que expresan hTRPC6 (negro) o hTRPC6mut (rojo) estimuladas con OAG (100 µM) 60 s después de comenzar el experimento y después de 300 s con hiperforina (10 µM). se aplicó. E Se monitorearon trazas de tiempo representativas en células HEK293 ctl (línea discontinua), células HEK293 que expresan hTRPC3 (gris) o hTRPC3mut (azul) estimuladas con OAG (100 µM) 60 s después de comenzar el experimento y después de 300 s con hiperforina (10 µM). se aplicó. F Corrientes de células enteras registradas a partir de células HEK293 ctl (línea discontinua), células HEK293 que expresan hTRPC6 (negro) o hTRPC6mut (rojo). La aplicación de hiperforina (10 µM) dio como resultado un aumento en la corriente de entrada y salida en las células que expresan hTRPC6. Este efecto se pierde en las células que expresan TRPC6mut. G Corrientes de células enteras registradas a partir de células HEK293 ctl (línea discontinua), células HEK293 que expresan hTRPC3 (gris) o hTRPC3mut (azul). La aplicación de hiperforina (10 µM) no mostró ningún efecto en las células que expresan ctl y hTRPC3, pero dio como resultado un aumento en la corriente de entrada y salida en las células que expresan hTRPC3mut. H El sitio de unión de hiperforina LLKL en hTRPC6 humano difiere en el último aminoácido del TRPC6 LLKF de rata y ratón. Para probar si este aminoácido interfiere con la unión de hiperforina a TRPC6, comparamos hTRPC6 con hTRPC6 LLKF. Las imágenes de calcio unicelular se realizaron en células HEK239 que expresan transitoriamente hTRPC6 o hTRPC6 LLKF. Las células se estimularon con hiperforina (10 µM) y se analizaron los cambios en la proporción de Fura-2-AM 340/380 nm y luego se convirtieron en Ca2+ intracelular en nM. No se observaron diferencias significativas (n = 3 ± SEM, las células se seleccionaron según su fluorescencia eYFP; la significación estadística se calculó mediante la prueba t no apareada, no significativa 0,0576).

Para caracterizar aún más el motivo LLKL en el extremo C de TRPC6 como un supuesto sitio de unión de hiperforina, probamos el mutante hTRPC6 en registros electrofisiológicos. Los registros de células completas de células HEK293 que expresan hTRPC6 dan como resultado relaciones corriente-voltaje comparables con datos anteriores (Fig. 4C, F). En soluciones extracelulares estándar, la relación corriente-voltaje de la corriente SAG (Figuras suplementarias 3A, B y 2C), medida a partir de rampas de voltaje, tiene una forma rectificadora externa, comparable con las curvas resultantes de la aplicación de hiperforina (Figura 4F). . La hiperforina no muestra ningún efecto sobre las células HEK293 no transfectadas (Fig. 4F). El mutante hTRPC6 708IMRI711 todavía presenta las propiedades de la relación corriente-voltaje de la corriente SAG (Fig. Suplementaria 3B, C) pero no reacciona a la hiperforina (10 µM) (Fig. 4C, F).

Dado que TRPC6 y TRPC3 comparten homología estructural y secuencial, nos preguntamos si TRPC3, que normalmente no responde a la hiperforina, puede sensibilizarse a este compuesto trasplantando el motivo LLKL de TRPC6 a TRPC3. Como se esperaba, WT hTRPC3 no puede activarse mediante hiperforina en experimentos de imágenes de calcio unicelulares ni en grabaciones de parches de células completas. La adición de OAG (100 µM) conduce a una fuerte afluencia de Ca2+ en las células HEK que expresan transitoriamente hTRPC3 (Fig. 4B, G). Por el contrario, la hiperforina induce una corriente entrante en el mutante hTRPC3 que porta el motivo de unión LLKL (Fig. 4C, G), lo que muestra que este motivo es necesario y suficiente para dotar a TRPC3 o TRPC6 de sensibilidad a la hiperforina.

Dado que nuestros experimentos de comportamiento se llevaron a cabo en ratones, investigamos más a fondo la activación mediada por hiperforina de TRPC6 murino que se muestra en la Fig. 4H para complementar los datos basados ​​en células sobre hTRPC6 humano descrito anteriormente. En experimentos de pinzamiento de parche y de imágenes de calcio unicelular, previamente no obtuvimos diferencias obvias entre las corrientes de salida mediadas por hiperforina o la entrada de Ca2+ en las dos especies. Sin embargo, el último aminoácido del motivo de unión a hiperforina TRPC6 humano LLKL está alterado a LLKF en TRPC6 murino (ver Figuras complementarias 1 y 4H). De este modo, comprobamos si una sustitución de leucina por fenilalanina en el canal TRPC6 humano afecta la activación de la hiperforina. Al utilizar células HEK293 que expresan transitoriamente el mutante hTRPC6 LLKF, solo observamos cambios menores en los experimentos de imágenes de calcio unicelulares en comparación con WT hTRPC6 (Fig. 4H). Estos resultados sugieren que el último aminoácido del motivo de unión de LLKL podría desempeñar solo un papel menor en la activación de hTRPC6 mediada por hiperforina.

El sitio de unión de la hiperforina dentro del extremo C de hTRPC6, el motivo 777LLKL780, se localiza intracelularmente en una región del canal (residuos 768–853) que no se resuelve en las estructuras crio-EM informadas de hTRPC6 (modelo de topología de la Fig. 4) [ 19, 20]. Por tanto, se sospecha que estas estructuras están desordenadas o muy flexibles. Para identificar la estructura secundaria general del péptido C-terminal TRPC6 y examinar posibles cambios estructurales tras la interacción de la hiperforina, medimos los espectros de CD de péptidos aislados que portan el motivo 777LLKL780 o su tramo 777IMRI780 mutado (Fig. 5A, C). El péptido TRPC6 tiene una estructura helicoidal α en ausencia y presencia de hiperforina (5 µM) (Fig. 5A), pero no se observan cambios en la estructura secundaria general en respuesta al aumento de las concentraciones de hiperforina. Debido a la interferencia de la hiperforina con la luz circulante, no es posible agregar hiperforina a concentraciones superiores a 5 µM. Este péptido C-terminal TRPC6 contiene numerosos residuos hidrofóbicos, lo que podría indicar que puede interactuar con los lípidos. Por lo tanto, monitoreamos la interacción del extremo C-terminal de TRPC6 y su mutante con las membranas lipídicas, la influencia de la hiperforina en esta interacción y si la hiperforina interactúa directamente con la región C-terminal de TRPC6 aislada (Fig. 5) mediante el uso de la membrana. tinte fluorescente permeable Laurdan (Fig. 5B), que monitorea la accesibilidad al agua y, por lo tanto, actúa como un indicador de la fluidez de la membrana [39] o el residuo de triptófano nativo W783 de los péptidos para mediciones de fluorescencia (Fig. 5D-F).

Espectros CD de péptidos TRPC6 de tipo salvaje en ausencia y presencia de hiperforina (A). Medición de fluorescencia de Laurdan para monitorear los cambios en la fluidez de la membrana causados ​​por la hiperforina (barras blancas), el péptido TRPC6 (barras negras) y el péptido TRPC6mut (barras rojas) (B). Las secuencias de aminoácidos de TRPC6 y TRPC6mut se muestran en (C). Las diferencias entre las dos secuencias están subrayadas. Fluorescencia de triptófano utilizando el residuo W782 como indicador de TRPC6 (D) y TRPC6mut titulado con hiperforina (E). Los máximos de fluorescencia (línea negra vertical en D y E) se transfirieron frente a la concentración de hiperforina y se normalizaron frente a los máximos de fluorescencia sin hiperforina (F).

La medición de fluorescencia de Laurdan es una herramienta para monitorear los cambios de fluidez en liposomas o membranas. Los valores de polarización generalizada (GP) de liposomas POPC-POPG con Laurdan se registraron tras la adición de hiperforina y en presencia de dos péptidos que representan una región C-terminal TRPC6 nativa que alberga el motivo LLKL o los residuos correspondientes 708IMRI711 de TRPC3 (Fig. 5C , TRPC6mut). En presencia de hasta 10 µM de hiperforina, los valores de ΔGP de los liposomas POPC-POPG no cambian (Fig. 5B, barras blancas). Por tanto, la hiperforina por sí sola no influye en la fluidez de la membrana en estas condiciones. Por el contrario, la adición de cualquiera de los péptidos TRPC6 produce un fuerte aumento en los respectivos valores de ΔGP, lo que indica una rigidez de la membrana causada por la unión del péptido. Curiosamente, el efecto del péptido TRPC6 mutado es menos pronunciado que el del péptido WT (Fig. 5B, barras rojas frente a negras). Tras la adición de hiperforina al complejo peptídico liposómico, el valor de ΔGP con el péptido WT TRPC6 aumenta aún más, mientras que los valores de ΔGP con TRPC6mut permanecen estables. Por lo tanto, el péptido WT TRPC6 y la hiperforina conducen sinérgicamente a una fluidez reducida de la membrana ya en concentraciones bajas de hiperforina. Para investigar si la hiperforina puede interactuar directamente con los péptidos, utilizamos la fluorescencia del triptófano aprovechando el único residuo de triptófano nativo, W783, que se encuentra junto al sitio de unión de hiperforina propuesto. La fluorescencia del triptófano es muy sensible a los cambios en el entorno, como la hidrofobicidad, y por tanto puede informar sobre la unión del ligando. Al titular la hiperforina en los dos péptidos TRPC6, se observa una disminución en la intensidad de la fluorescencia (Fig. 5D-F). Es importante destacar que el péptido TRPC6mut muestra una interacción significativamente reducida con la hiperforina, lo que indica que el motivo LLKL de hecho juega un papel importante en la interacción de la hiperforina.

La hiperforina (Fig. 6A) es un derivado de acilfloroglucinol bicíclico poliprenilado que no es muy estable cuando se expone a la luz y al oxígeno e induce interacciones entre fármacos [30]. Por lo tanto, previamente preparamos 2,4-diacilfloroglucinoles simplificados que son químicamente estables y demuestran actividad y selectividad similares para TRPC6 pero no activan PXR [30]. Aquí, caracterizamos los efectos de un nuevo derivado de floroglucinol, Hyp13 (Fig. 6B), sobre las corrientes internas mediadas por TRPC6 en células HEK293 que expresan transitoriamente canales TRPC6. La relación corriente-voltaje de la corriente inducida por Hyp13, medida a partir de rampas de voltaje, tiene una forma rectificadora externa, comparable con las curvas resultantes de la aplicación de hiperforina (Fig. 6C). Hyp13 (10 µM) es selectivo para TRPC6 (Fig. 6D) y no activa TRPC3 (Fig. 6E). En las células HEK293 que expresan transitoriamente hTRPC6, Hyp13 (10 µM) induce en experimentos con calcio unicelular una entrada de Ca2+ robusta y transitoria (Fig. 6D, E) comparable a los efectos de la hiperforina. En hTRPC3 que expresa células HEK293, Hyp13 (10 µM) similar a la hiperforina (10 µM) no provoca la entrada de Ca2+ en experimentos de imágenes de calcio de células individuales (Fig. 6D, F). En experimentos de abrazadera de parche de células enteras en hTRPC6 que expresan células HEK293, Hyp13 (10 µM) inicia una corriente rectificadora externa (Fig. 6G) comparable a los efectos de la hiperforina (10 µM). Hyp13 (10 µM) no muestra efectos sobre hTRPC3 que expresa células HEK293 (Fig. 6D, H). Además, la entrada de Ca2+ inducida por Hyp13 (Fig. 6D, E) y el canal rectificador de salida se pierden en las células HEK293 que expresan transitoriamente el mutante TRPC6 IMRI (Fig. 6G). Por el contrario, en las células HEK293 que expresan el mutante TRPC3 LLKL, se restaura la entrada de Ca2+ (Fig. 6D, F) y el canal rectificador de salida inducido por Hyp13 (Fig. 6H). Estos resultados sugieren que la hiperforina y Hyp13 comparten el mismo sitio de unión en hTRPC6.

Estructura química de hiperforina (A) y Hyp13 (B). La estructura central del floroglucinol está resaltada en rojo. (C) Efecto dependiente de la concentración de Hyp13 en células HEK293 que expresan canales hTRPC6 en experimentos de pinzamiento de parche de células completas. D Hyp13 también interactúa con el motivo de unión LLKL en TRPC6. Se realizaron imágenes de Ca2+ unicelulares en células HEK293 que expresan transitoriamente el vector plásmido pcDNA3.1 con ADN que codifica solo para eYFP (ctl, blanco), hTRPC6 (negro), hTRPC6mut (rojo), hTRPC3 (gris) o hTRPC3mut (azul). expresado como proteínas de fusión eYFP C-terminales. Las células se estimularon con hiperforina (10 µM) o Hyp13 (10 µM) y se detectaron alteraciones de Ca2+ intracelular utilizando fura-2 AM (n = 7–9 ± SEM, las células se seleccionaron según su fluorescencia eYFP y su sensibilidad a OAG). E Se monitorearon trazas de tiempo representativas en células HEK293 ctl (línea discontinua), células HEK293 que expresan hTRPC6 (negro) o hTRPC6mut (rojo) estimuladas con OAG (100 µM) 60 s después de comenzar el experimento y después de 300 s con hiperforina (10 µM). se aplicó. F Se monitorearon trazas de tiempo representativas en células HEK293 ctl (línea discontinua), células HEK293 que expresan hTRPC3 (gris) o hTRPC3mut (azul) estimuladas con OAG (100 µM) 60 s después de comenzar el experimento y después de 300 s con hiperforina (10 µM). se aplicó. G Corrientes de células completas registradas a partir de células HEK293 ctl (línea discontinua), células HEK293 que expresan hTRPC6 (negro) o hTRPC6mut (rojo). La aplicación de Hyp13 (10 µM) dio como resultado un aumento en la corriente de entrada y salida en las células que expresan hTRPC6. Este efecto se pierde en las células que expresan TRPC6mut. H Corrientes de células completas registradas a partir de células HEK293 ctl (línea discontinua), células HEK293 que expresan hTRPC3 (gris) o hTRPC3mut (azul). La aplicación de Hyp13 (10 µM) no mostró ningún efecto en las células que expresan ctl y hTRPC3, pero dio como resultado un aumento en la corriente de entrada y salida en las células que expresan hTRPC3mut.

Para probar si las propiedades de interacción fármaco-fármaco de la hiperforina también se pierden en nuestro derivado de florogcinol recientemente caracterizado, investigamos si Hyp13 activa PXR utilizando un ensayo basado en la construcción de fusión GAL4 destinado a monitorear la unión de una sustancia al dominio de unión al ligando de PXR. 40, 41]. Antes de comenzar este experimento, investigamos la citotoxicidad de Hyp13 en comparación con la hiperforina después de 24 h de tratamiento (Figura complementaria 4). Hyp13 indujo efectos citotóxicos comparables a los de la hiperforina en células HepG2 y HepaRG. Como se describió anteriormente, la hiperforina activa fuertemente y de manera dependiente de la concentración PXR, como los conocidos agonistas de PXR SR12813 y rifampicina (Fig. 7A, Fig. Suplementaria 4). Por el contrario, casi no se observó activación después del tratamiento con Hyp13 (Fig. 7A, Fig. 4 complementaria).

Inducción de la actividad PXR por hiperforina y su derivado en células HepG2 (A). Las células HepG2 se cotransfectaron con plásmidos que expresaban luciferasa de luciérnaga impulsada por UAS sensible a GAL4, PXR-LBD humano fusionado con GAL4-DBD y luciferasa de Renilla. Las células transfectadas se expusieron a 10 µM de controles positivos de rifampicina y SR12813 o diferentes concentraciones de hiperforina y su derivado. Después de 24 h, se analizó la actividad de luciferasa de luciérnaga y Renilla en los lisados ​​celulares. La actividad de la luciferasa de luciérnaga se normalizó frente a la actividad de la luciferasa de Renilla y se calculó el doble de inducción con respecto al control de disolvente (SC 0,5% DMSO). Los datos se presentan como medias ± DE de tres experimentos independientes realizados con seis repeticiones cada uno. B Análisis de la expresión génica de CYP3A4. Se expusieron células HepaRG diferenciadas a hiperforina y su derivado, así como a rifampicina (PC) 10 µM durante 24 h. El ARNm total se aisló y se transcribió en ADNc y posteriormente se analizó la expresión del ARNm de CYP3A4 mediante qPCR en tiempo real. Para la cuantificación relativa, los valores de Ct se normalizaron con respecto a los genes de referencia (ACTB y GAPDH) según el método ΔΔCT. Se calcularon los cambios log2 veces de los valores 2-ΔΔCT y los niveles de ARNm se expresaron en relación con el control de disolvente (SC 0,5% DMSO). Los datos se presentan como medias ± DE de dos o tres experimentos independientes.

Posteriormente, se analizó la expresión del ARNm de CYP3A4 (ver Fig. 7B) y reveló una fuerte activación de CYP3A4 por la hiperforina en un nivel comparable con el de la rifampicina de control positivo, mientras que Hyp13 no causó ningún efecto pronunciado.

Lo más importante es que probamos si los canales TRPC6 son esenciales para los efectos ansiolíticos y antidepresivos mediados por Hyp13. Hyp13 muestra efectos antidepresivos y ansiolíticos en ratones macho B6J; 129S8 WT en varias pruebas indicativas de depresión y ansiedad, como la prueba de campo abierto (Figura complementaria 5), ​​alimentación novedosa suprimida (Figura complementaria 6) o prueba de natación forzada ( Figura complementaria 7). Nos centramos en un paradigma de comportamiento que se vio fuertemente afectado en ratones macho TRPC6 KO: la prueba de campo abierto. Encontramos un aumento significativo del tiempo central, la locomoción central y las entradas centrales a una concentración de 5 mg/kg en ratones WT. Con estos resultados, aplicamos Hyp13 (5 mg/kg) a ratones TRPC6 KO y observamos una pérdida de los efectos ansiolíticos de Hyp13 en la prueba de campo abierto en comparación con ratones WT (Fig. 8). Estos hallazgos sugieren que los efectos emocionales de Hyp13 dependen de TRPC6.

Los efectos ansiolíticos de Hyp13 (Hyp) dependen de TRPC6. Los efectos ansiolíticos se mostraron en la prueba de campo abierto medidos por el tiempo del centro A, las entradas del centro B y la locomoción del centro C. Los ratones knockout (KO) para TRPC6 no muestran estos efectos. Los datos se expresan como medias ± sem (n = 11–12 por grupo; *p <0,05, **P <0,001).

En este estudio, caracterizamos el papel del canal TRPC6 en los efectos antidepresivos de la hiperforina. Informamos que los ratones TRPC6 KO muestran un comportamiento mejorado similar a la depresión y la ansiedad. Un mecanismo probable para este fenotipo es el cambio observado en la excitabilidad de las neuronas DG y CA1 del hipocampo. Demostramos que la hiperforina excita las neuronas del hipocampo de forma dependiente de TRPC6. Posteriormente, identificamos un motivo de unión esencial para la hiperforina en el extremo C de TRPC6. Para superar las propiedades químicas desventajosas de la hiperforina como compuesto principal antidepresivo, sintetizamos el derivado de floroglucinol Hyp13. Mostramos que el análogo de hiperforina Hyp13 actúa a través del motivo de unión de hiperforina en TRPC6. Finalmente, proporcionamos evidencia de que Hyp13 tiene acciones antidepresivas dependiendo de los canales TRPC6.

Los ratones TRPC6 KO mostraron respuestas mejoradas similares a la ansiedad en el campo abierto y en la prueba de laberinto elevado y mostraron un mayor comportamiento similar a la depresión en la prueba de natación forzada y en la prueba de preferencia de sacarosa, lo que refleja la capacidad del animal para experimentar placer hedónico. Hasta ahora, el comportamiento relacionado con la depresión no se había investigado en ratones TRPC6 KO. Sin embargo, el estrés crónico impredecible combinado con el aislamiento en ratas conduce a una expresión reducida de TRPC6 en el hipocampo [42]. La plasticidad sináptica disminuida se reflejó en una LTP deteriorada, una reducción en la longitud dendrítica y la densidad de las espinas, así como en una tinción de densidad postsináptica reducida 95 (PSD-95), un sustituto de la densidad de las postsinapsis. Datos publicados recientemente sugieren que la eliminación viral de TRPC6 en el DG de ratones tiene un efecto desventajoso sobre los procesos cognitivos y el comportamiento similar a la ansiedad [43]. De manera similar, a nuestros resultados, los animales tratados con shRNA-TRPC6 pasaron menos tiempo en el área central de la prueba de campo abierto que el grupo de control, lo que indica un comportamiento similar a la ansiedad. Los ratones del grupo shRNA-TRPC6 tampoco pudieron discriminar entre ratones nuevos y familiares en la prueba de tres cámaras y exhibieron problemas de aprendizaje espacial y memoria de trabajo. Otros han descrito el impacto de TRPC6 en el aprendizaje y la memoria. Utilizando el campo cuadrado abierto y la prueba del laberinto estelar elevado, se encontró una actividad exploratoria reducida en ratones TRPC6 KO [44, 45]. En Morris Water Maze, los ratones transgénicos que sobreexpresaban TRPC6 mostraron una mejora en el aprendizaje espacial y la memoria [26]. Teniendo en cuenta que la cognición alterada es uno de los síntomas de la depresión mayor y la depresión mayor es uno de los principales factores de riesgo de demencia, TRPC6 podría ser un vínculo entre estas enfermedades psiquiátricas. Varios estudios demostraron que la hiperforina, el activador selectivo de TRPC6, reduce los niveles de Aβ y mejora el comportamiento en modelos animales de la enfermedad de Alzheimer (EA) y en estudios in vitro [46]. Además, se encontró una reducción de la expresión de TRPC6 en pacientes con EA y deterioro cognitivo leve, lo que se correlacionó negativamente con el rendimiento cognitivo [10].

El comportamiento ansioso y similar a la depresión observado en los ratones TRPC6 KO estuvo acompañado de una excitabilidad neuronal reducida en las células granulares DG y las neuronas piramidales CA1. Esta excitabilidad alterada coincide con la expresión del canal TRPC6, que se expresa principalmente en las neuronas DG, las neuronas piramidales y las interneuronas del hipocampo. El hipocampo es una región del cerebro altamente sensible al estrés y su disfunción puede contribuir a los déficits de concentración entre las características diagnósticas de la depresión mayor [47]. La respuesta a la novedad está regulada por aferencias del hipocampo que se proyectan al núcleo accumbens y al área tegmental ventral [48]. También se considera que la función alterada del hipocampo está implicada en la anhedonia [49]. Las células DG y las células piramidales CA1 de ratones TRPC6 KO demuestran una excitabilidad celular significativamente reducida. Griesi-Oliveira et al. obtuvieron datos similares. regulación negativa de TRPC6 en neuronas primarias de ratón utilizando shRNA [45]. Sin embargo, dado que los canales TRPC6 se expresan principalmente en interneuronas en CA1 [23], la excitabilidad reducida en las neuronas CA1 en ratones TRPC6 KO también podría ser inducida por un mecanismo homeostático debido a la falta crónica de TRPC6 en las interneuronas CA1. Los registros de células completas de AP revelaron una reducción significativa en la tasa de activación de las neuronas que expresan shRNA contra TRPC6 en comparación con los controles. En particular, también se ha observado una activación aberrante de AP en respuesta a la despolarización de la membrana en neuronas tipo DG derivadas de iPSC de pacientes con trastorno bipolar [50]. Airan et al. proporcionó evidencia de que las neuronas DG muestran cambios dinámicos en modelos de depresión y después del tratamiento crónico con ISRS [51]. Utilizando imágenes de tintes sensibles al voltaje, la actividad de DG se redujo en un modelo de estrés crónico leve y se revirtió después del tratamiento crónico con fluoxetina. Esta actividad reducida probablemente esté mediada por la atrofia en las dendritas de DG. Varios grupos demostraron el papel de TRPC6 en la morfología y arborización de la columna dendrítica. El uso de vectores virales adenoasociados (AAV) que expresan ARN de horquilla corta (shRNA) dirigidos a TRPC6 en el hipocampo DG de ratones macho, redujo la expresión de la proteína TRPC6 y disminuyó las espinas dendríticas de las neuronas granulares de DG [43]. Estos datos sugieren que el comportamiento ansioso y depresivo en los ratones TRPC6 KO podría ser causado por una excitabilidad reducida en las neuronas DG asociada con un número reducido de espinas y dendritas. Por el contrario, la hiperforina mejora la plasticidad sináptica en el hipocampo y la corteza prefrontal al alterar la morfología de la columna [24] y la expresión de los receptores CREB [52, 53], BDNF [54] y TrKB [42, 55].

Si bien estudios anteriores, que comprenden el FST, paradigmas de impotencia aprendida, modelos de déficit de evitación y el EPM demostraron el efecto antidepresivo y ansiolítico de la hiperforina [42, 54, 56,57,58], un informe reciente cuestionó si la hiperforina es un activador específico de TRPC6 [ 7, 8]. En este estudio, la hiperforina aumentó la excitabilidad de las neuronas DG en ratones WT. Este efecto fue anulado en ratones TRPC6 KO, al igual que la corriente interna inducida por hiperforina. Dado que la corriente retardada mediada por potasio inducida por hiperforina persiste en ratones TRPC6 KO, este podría ser un mecanismo de acción independiente. Para investigar más a fondo la interacción de la hiperforina con TRPC6, realizamos experimentos de mutagénesis dirigida al sitio centrándose en aminoácidos que difieren entre TRPC6 y los canales TRPC3 y TRPC7 estrechamente relacionados que no pueden ser activados por la hiperforina. Por lo tanto, pudimos identificar un motivo de unión en el extremo C de TRPC6, 777LLKL780, que media la sensibilidad a la hiperforina. Estos cuatro residuos, que no se conservan dentro de la familia TRPC, se encuentran entre el reentrante de TRP y la hélice 1 C-terminal, una región con aminoácidos desordenados (766–854) en estructuras crio-EM [19, 22]. Esta región también contiene los sitios de unión putativos de hexafosfato de inositol (842–868) y el receptor de calmodulina/IP3 (838–872) [59]. El aumento del influjo de Ca2+ mediado por TRPC6 por SAG y OAG, ambos análogos del agonista lipídico nativo DAG, no se alteró en los canales mutantes. Nuestros resultados sugieren que ni el plegamiento de proteínas, ni el tráfico ni la expresión superficial de TRPC6 se ven afectados por el motivo de unión a hiperforina 777LLKL780.

Además, demostramos que tras el aislamiento, esta región es α-helicoidal e interactúa con los liposomas y afecta la fluidez de la membrana. La espectroscopia de fluorescencia de triptófano que aprovecha un residuo nativo en las proximidades del sitio de unión de hiperforina propuesto indica que, de hecho, existe una interacción directa entre la región C-terminal de TRPC6 y la hiperforina. Esta interacción se reduce cuando se muta el motivo 777LLKL780. Curiosamente, la interacción de la membrana y los cambios de fluidez resultantes también se ven potenciados por la presencia de hiperforina.

Dado que la hiperforina muestra varias deficiencias, como una mala estabilidad química o la inducción de interacciones entre fármacos como compuesto principal para futuros desarrollos [29], sintetizamos e investigamos un análogo de hiperforina estable y químicamente simplificado, que comparte el núcleo de floroglucinol, Hyp13. Hyp13 se basa en los derivados Hyp de nuestro grupo publicados anteriormente y comparte todas las características con la hiperforina. Demostramos que Hyp13 activa TRPC6 con una potencia similar, no muestra ningún efecto sobre TRPC3 y se une al motivo de unión identificado LLKL. Además, Hyp13, a diferencia de la hiperforina, no activa PXR ni induce CYP3A4. Estos hallazgos indican que Hyp13 tiene un perfil de interacción favorable en comparación con la hiperforina, que se sabe que provoca interacciones farmacológicas graves. Sin embargo, la hiperforina y Hyp13 mostraron efectos citotóxicos similares en concentraciones superiores a 5 µM después de 24 h en células HepG2 y HepaRG. Estas concentraciones están muy por encima de las alcanzadas en experimentos de comportamiento en ratones. Para la hiperforina, se observaron concentraciones cerebrales nanomolares después del tratamiento oral en ratones que coincidían con las concentraciones necesarias para alterar la plasticidad sináptica mediante la activación de los canales TRPC6 [24, 60]. Es importante destacar que Hyp13 exhibe efectos antidepresivos y ansiolíticos en la prueba de campo abierto, la prueba de alimentación suprimida y la prueba de natación forzada. Cabe señalar que estos efectos ya se observaron después del tratamiento agudo, mientras que la hiperforina en humanos requiere varias semanas para mostrar una acción antidepresiva completa. Esto podría sugerir una acción más rápida de Hyp13 en comparación con la hiperforina. Sin embargo, las pruebas aplicadas muestran una validez predictiva en el sentido de que indican la acción del fármaco, pero no en la escala de tiempo humana, como se muestra con otros fármacos antidepresivos [61]. Los efectos emocionales de Hyp13 se redujeron en ratones TRPC6 KO.

En resumen, demostramos el papel de los canales TRPC6 para la depresión y la ansiedad y proporcionamos evidencia de que los canales TRPC6 son nuevos objetivos farmacológicos para terapias en los trastornos del estado de ánimo. Estos resultados también podrían allanar el camino para que nuevas moléculas traten otras enfermedades psiquiátricas asociadas con la disfunción TRPC6, como el autismo o la enfermedad de Alzheimer.

La hiperforina fue amablemente suministrada por el Dr. Willmar Schwabe (Karlsruhe, Alemania). La hiperforina y Hyp13 se diluyeron en dimetilsulfóxido (DMSO; Carl Roth, Karlsruhe, Alemania #A994.1) y se almacenaron hasta su uso a –20 °C. Se resolvió 1-oleoil-2-acetil-sn-glicerol (OAG; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania; #O6754) en DMSO y se almacenó en una solución madre 100 mM, 1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicerol-d8 (SAG; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE. UU.; #sc-220503) se resolvió en DMSO y se almacenó en una solución madre de 50 mM a –20 °C. La rifampicina (CAS 13292-46-1) y SR12813 (CAS 126411-39-0) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemania). Los productos químicos de laboratorio estándar se obtuvieron de Sigma-Aldrich o Carl Roth.

Hyp13 se sintetizó según Bharate et al. [62]. se realizó en una secuencia de dos pasos a partir de floroglucinol, que primero se trató con cloruro de isovalerilo en condiciones de Friedel-Crafts para producir Hyp1. Posteriormente, se obtuvo Hyp13 mediante alquilación de Hyp1 con 1-yodobutano en presencia de metóxido de sodio como base y separación cromatográfica de los isómeros formados.

Se utilizaron como plantillas para hTRPC6 777IMRI780-eYFP y hTRPC3 708LLKL711-eYFP el vector plasmídico pcDNA3.1 con ADN que codifica TRPC6 humano (Uniprot ID: Q9Y210) y TRPC3 humano (Uniprot ID: Q13507), ambos C-terminalmente fusionados a eYFP. mutantes. Para la mutagénesis dirigida al sitio, utilizamos secuencias de cebadores (hechas a medida por Sigma Aldrich, Alemania) que codifican las mutaciones planificadas. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes:

5′TCTGGTGCCGAGTCCAAAGTCCCTGTTTTATCTCATAATGCGCATTAAAAAATGGATTTCTGAGCTGTTCCAGGGGCC

5′GCTCAGAAATCCATTTTTTAATGCGCATTATGAGATAAAACAGGGACTTTGGACTCGGCACCAGATTGAAGGGTACAGG;

5′-GTTTATTTCCTCCTGAAACTTGTTAACTTTCCCAAATGCAGAAGGAGAAG;

5′-TGGGAAAGTTAACAAGTTTCAGGAGGAAATAACAAATGATTTTGGACTAGG.

Las PCR se llevaron a cabo utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial durante 3 min a 95 °C y 25 ciclos de desnaturalización durante 20 s a 98 °C, hibridación entre 75-80 °C durante 15 s y extensión a 72 °C durante 5 min. . La amplificación se realizó utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad (Roche, Mannheim, Alemania; #KK2101). El ADN molde se eliminó mediante digestión usando DpnI (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania; # R0176S) y el ADN amplificado se usó para la transformación de células DH5α Escherichia coli competentes (ThermoFisherScientific, Darmstadt, Alemania; #18265017). Se aislaron ADN plásmidos de varios clones de placas de agar previamente vertidas con ampicilina 100 μg/ml y se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. Para la transfección, se realizaron preparaciones de ADN a gran escala utilizando el kit Plasmid Maxiprep (Zymo Research Europe GmbH, Freiburg im Breisgau, Alemania; #D4202).

Se cultivaron células de riñón embrionario humano (HEK 293) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; ThermoFisherScientific, Darmstadt, Alemania; n.° 41965039) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 % (FCS; ThermoFisherScientific, Darmstadt, Alemania; n.° 10500-064). ) y penicilina/estreptomicina 10 mM (Pen-Strep; ThermoFisherScientific, Darmstadt, Alemania; n.º 15140122) a 37 °C. Para la transfección, se cultivaron células HEK 293 en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania; n.° P2636) en placas de 6 pocillos con una densidad de 0,1 × 106 células por pocillo para obtener imágenes de calcio de una sola célula. y western blot y con una densidad de 0,5 × 105 células para mediciones electrofisiológicas. Después de 24 h, se intercambió el medio y las células se transfectaron transitoriamente con un cóctel de transfección que contenía 0,5–1 μg de ADN, 2 μl de reactivo de transfección Effectene (Qiagen, Hilden, Alemania; #301425) y 50 μl de Opti-MEM (ThermoFisherScientific, Darmstadt, Alemania; #51985034) medio. La imagen de calcio unicelular, la transferencia Western y el estudio electrofisiológico se llevaron a cabo 24 h después de la transfección. Todas las líneas celulares dieron negativo para la contaminación por micoplasma mediante la prueba de PCR.

Las células HEK 293 transfectadas y no transfectadas se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,3), se sedimentaron y se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Tris-HCl 50 mM, Triton X-100 al 1%, NaCl 150 mM, 0,5%). % de desoxicolato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1 %, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM que contiene un cóctel inhibidor de proteasa cCOMPLETETM (Roche, Mannheim, Alemania; n.º 04693159001). Las muestras se lisaron durante 30 minutos. a 4 ° C y se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se agregaron a 4 x tampón SDS-Laemmli (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania # K929.1) y se hirvieron, y las proteínas se separaron en un 8%. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Los geles se transfirieron a membranas de PVDF a 80 mV durante 2 h a 4 °C. Las membranas de PVDF se bloquearon durante 3 h con albúmina sérica bovina al 5% (BSA; Carl Roth, Karlsruhe , Alemania; #T844.3) en tampón TBS (Tris 20 mM, NaCl 150 mM) con Tween 20 al 0,1%, incubado con anticuerpos específicos para TRPC6 (Alomone Labs, Jerusalén, Israel; #ACC-017) diluido 1:400 veces, TRPC3 (Cell Signaling, Frankfurt am Main, Alemania; #D4P5S) diluido 1:1000 veces y ß-actina (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania; #A1978) diluido 1: 2000. Los anticuerpos TRPC6 y TRPC3 se diluyeron en TBS/tampón Tween 20 al 0,1 % con BSA al 5 % y el anticuerpo b-actina se diluyó en TBS/tampón Tween 20 al 0,1 % con BSA al 1 %. Las membranas se lavaron tres veces en tampón TBS/Tween 20 al 0,5%, se incubaron durante 60 minutos con anticuerpos acoplados a peroxidasa de rábano picante contra los anticuerpos primarios, se lavaron nuevamente tres veces en tampón TBS/Tween 20 al 0,5% y se revelaron con el reactivo de quimioluminiscencia electrogenerado ( ECL; GE Healthcare Europe, Munich, Alemania; #RPN2236). La visualización de transferencia Western se llevó a cabo utilizando el sistema de imágenes iBright CL1500 (ThermoFisherScientific, Darmstadt, Alemania).

Los registros de parche-clamp de células enteras se realizaron en células HEK 293. Se fabricaron pipetas de parche a partir de capilares de vidrio de borosilicato (Science Products, Hofheim, Alemania; GB150F-10P) con un extractor de micropipetas P-1000 (Sutter Instruments, Novato, EE. UU.). La resistencia de la pipeta varió de 4 a 8 MΩ. Las corrientes de celda completa se generaron mediante rampas de voltaje de –100 a +100 mV (400 ms de duración) aplicadas cada 10 s desde un potencial de mantenimiento de 0 mV. Las corrientes a través de la pipeta se registraron mediante el amplificador USB EPC 10 y el software patchmaster (Patchmaster, HEKA Electronics, RRID:SCR_000034, Alemania), se filtraron a 2,9 kHz (filtro Bessel), se digitalizaron a 4 kHz y se analizaron utilizando el software Fitmaster (Fitmaster, HEKA). Electronics, Lambrecht, Alemania; RRID:SCR_016233) e Igor Pro 8.0 (Wavemetrics, Tigard, EE. UU.). Se registró una célula por cubreobjetos y se estudiaron al menos tres preparaciones celulares independientes para cada experimento. Las pipetas se llenaron con una solución intracelular que contenía CsCH3O3S 130 mM, CsCl 10 mM, MgCl2 2 mM y HEPES 10 mM (pH 7,2 con CsOH). La solución extracelular estándar contenía NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, glucosa 10 mM y HEPES 10 mM (pH 7,4 con NaOH).

Las mediciones de [Ca2+]i en células HEK293 se llevaron a cabo utilizando el indicador de fluorescencia éster fura-2-acitoximetílico (Fura 2-AM; ThermoFisherScientific, Darmstadt, Alemania; #F1201) combinado con un sistema de imágenes basado en monocromador (TILL Photonics; FEI, Gräfeling, Alemania) acoplado a un objetivo de inmersión en fluido (LUMPLFLN 40XW/0,80 w). Las células se cargaron con un cóctel compuesto por Fura 2-AM 2,5 μM, pluronic-F127 al 0,01% (ThermoFisherScientific, Darmstadt, Alemania; n.º P6866) durante 30 minutos a temperatura ambiente (22-24 °C) en una solución salina equilibrada de Hank estándar. Tampón (HBSS) compuesto por NaCl 138 mM, KCl 6 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM y HEPES (ácido [4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico]) 10 mM ajustado a pH 7,4 con NaOH a temperatura ambiente. . Posteriormente, las células se lavaron con HBSS y se dejaron durante otros 30 minutos a temperatura ambiente en HBSS. Luego se montaron cubreobjetos en una cámara de baño hecha de plexiglás en la platina del microscopio (Olympus BX51WI, Hamburgo, Alemania). El influjo de Ca2+ se registró y visualizó en el software TillVision Live Acquisition and Offline Analysis [anteriormente FEI Munich GmbH (Till Photonics), ahora Thermo Fisher Scientific] como una proporción de 340/380 nm con un objetivo de 40x. Fura2-AM unido a Ca2+ es excitable a 340 nm y el estado libre de Fura2-AM a 380 nm. La relación se calculó mediante análisis de emisión que era detectable a 510 nm después de la excitación con cada longitud de onda.

Los péptidos hTRPC6 y hTRPC6mut fueron sintetizados por péptidos y elefantes (Henningsdorf, Alemania). Específicamente, se obtuvo un péptido que comprende los residuos 766–811 del extremo C terminal de TRPC6 humano (766LVPSKSLFYLLKLKKWISELFQGHKKGFQEDAEMNKINEEKKL811) y el péptido que porta el motivo mutado IMRI identificado en TRPC3 (766LVPSKSLFYIMRIKKWISELFQGHKKGFQEDAEMNKINEEKKL811). Para eliminar las impurezas, los péptidos se disolvieron en Tris 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM y se dializaron contra el mismo tampón durante varios días. Para eliminar las sales, los péptidos se dializaron contra agua Milli-Q durante otros 7 días y la concentración final del péptido se ajustó a 100 µM o se liofilizó y almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.

Los espectros de CD se registraron en un espectrómetro de CD Jasco-815 a 25 °C y en un rango de longitud de onda de 190 a 260 nm. Los péptidos TRPC6 y TRPC6mut se disolvieron en Tris 10 mM, pH 8, NaCl 30 mM con una concentración de péptido de 20 µM.

Se mezclaron lípidos POPC y POPG en cloroformo en una proporción molar de 70:30. La mezcla de lípidos con una adición de 1-[6-(dimetilamino)-2-naftalenil]-1-dodecanona (Laurdan) (relación molar Laurdan:Lípido 1:500) se secó bajo flujo de nitrógeno y vacío para obtener una película lipídica. La película lipídica se resuspendió en Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM para alcanzar una concentración total de lípidos de 500 µM. Se prepararon pequeñas vesículas unilaminares (SUV) con cinco ciclos de congelación-descongelación y posterior extrusión a través de una membrana de 50 nm.

Se preincubaron 50 µM de la mezcla de lípido/Laurdan (ver arriba) con péptidos TRPC6 5 µM. Se añadió hiperforina con diferentes concentraciones a la mezcla y los espectros se registraron utilizando un fluorímetro Fluoromax-4 (Horiba Scientific). Los espectros de emisión se registraron entre 400 y 550 nm, con una longitud de onda de excitación de 340 nm y un ancho de rendija de 1 nm a 25 °C. Se utilizaron intensidades de fluorescencia a 440 nm y 490 nm para calcular el valor de polarización generado GP y en base a estos valores de ΔGP.

Todos los experimentos se llevaron a cabo en un fluorímetro Fluoromax-4 (Horiba Scientific) con una concentración de péptido de 5 µM en Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y los siguientes parámetros: longitud de onda de excitación: 280 nm, longitud de onda de emisión 300–450 nm. , ancho de hendidura 2 nm, 25 °C.

Se estudiaron ratones macho B6J; 129S8 de tipo salvaje (WT) y B6J; 129S8 -Trpc6tm1Lb1 (stock MMRRC NO 37345-Jax; TRPC6 KO). Los animales se alojaron en grupos en jaulas de macrolona estándar (Tipo III). Se les proporcionó comida y agua ad libitum, toallas de papel como enriquecimiento de la jaula y se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h (las luces se encienden a las 07:00 horas). Todos los ratones fueron evaluados a una edad de 3 a 4 meses. Las pruebas de comportamiento se realizaron durante el ciclo de luz entre las 09:00 y las 16:00 h. La temperatura ambiente se mantuvo entre 19 y 22 °C con una humedad del 55% (±10%). Todas las pruebas de comportamiento fueron realizadas por experimentadores ciegos a la hipótesis y/o al genotipo. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el trato humano de los animales y la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas (86/609/CEE) y fueron aprobados por la comisión gubernamental local para la salud animal (administración estatal alemana Baviera/Regierung von Mittelfranken).

Los ratones fueron evaluados en una batería de pruebas de comportamiento en el siguiente orden: campo abierto, laberinto elevado, caja clara y oscura, alimentación suprimida, prueba de natación forzada y pruebas de preferencia de sacarosa. Todas las pruebas se realizaron en días separados con 3 días entre pruebas individuales. Los ratones fueron evaluados en un orden pseudoaleatorio y fueron trasladados a la sala de comportamiento adyacente a la sala de alojamiento inmediatamente antes de la prueba. Cada aparato de prueba se limpió con etanol al 50% entre sujetos para evitar que cualquier señal olfativa influya en los comportamientos. Los ratones fueron devueltos a sus jaulas al final de cada prueba y se les permitió recuperarse. Sólo se analizaron los animales que mostraron buena salud durante todo el tiempo de prueba y de los cuales se pudo medir un conjunto completo de datos para cada paradigma respectivo. Los comportamientos de todas las pruebas se registraron en video para su posterior calificación por parte de un observador ciego a la hipótesis y al tratamiento. Los experimentos de comportamiento fueron realizados por experimentadores que solo recibieron números de animales y protocolos de prueba en el momento de la prueba. En los protocolos de prueba, el IP equilibró el orden de las pruebas y la asignación de las cajas de prueba de forma pseudoaleatoria. La asignación de tratamientos (aleatorización) para ratones en todos los estudios con animales se realizó extrayendo los números de animales de un contenedor. La asignación del tratamiento a los ratones mutantes y WT se realizó al azar extrayendo el número de animales.

Cada ratón se colocó en una arena acrílica blanca cuadrada (50 × 50 cm), frente a una pared exterior, durante 20 minutos (los parámetros se midieron en bloques de 5 minutos y se resumieron) y se les permitió explorar libremente la arena. Durante las pruebas se distribuyó uniformemente una luz blanca de 25 lx por toda la arena. Las grabaciones de vídeo se tomaron y analizaron utilizando Biobserve Viewer III (Biobserve, Bonn, Alemania). Un cuadrado virtual de igual distancia de la periferia (36 × 36 cm) se definió como la "zona central" para determinar el número de entradas y el tiempo pasado en la zona central. Se registraron la distancia recorrida en las zonas exterior y central (cm), el número de entradas y el tiempo pasado en la zona central [63,64,65].

La yegua plus elevada se construyó con acrílico negro opaco con revestimiento blanco en el piso, cada brazo medía 30 × 5 cm y la plataforma central 5 × 5 cm. Un conjunto de brazos, opuestos entre sí, estaba completamente encerrado por una pared de acrílico opaco, de 15 cm de alto, mientras que el otro conjunto estaba abierto con una repisa de 0,5 cm a cada lado de los brazos. El laberinto se elevó a 50 cm del suelo sobre un soporte acrílico transparente. Cada ratón se colocó en la plataforma central, mirando hacia un brazo cerrado, y se le permitió explorar libremente el laberinto durante 5 minutos. Se utilizó el software de seguimiento Biobserve Viewer III (Biobserve) para registrar la actividad locomotora durante la prueba (distancia recorrida en los brazos abiertos y cerrados), y el número de entradas en los brazos cerrados y abiertos y el tiempo transcurrido en ellos. Se contó una entrada de brazo cuando dos patas habían entrado en un brazo, y una salida de brazo se determinó cuando dos patas habían abandonado el brazo [63,64,65].

Para la prueba de natación forzada, cada ratón se colocó en un cilindro de vidrio transparente (17 cm de diámetro, 18 cm de altura) lleno de agua (12 cm, 25 °C) durante 15 minutos. Luego, el animal fue devuelto a la jaula de su hogar. Después de 24 h, los ratones se colocaron nuevamente en este cilindro con agua durante 5 min. La latencia de la primera flotación y el tiempo total de flotación se registraron manualmente [63,64,65].

Los animales se alojaron en un solo alojamiento y tuvieron acceso a dos botellas con agua 7 días antes de la prueba de preferencia de sacarosa. El día 8, el agua de una botella se reemplazó por una solución de sacarosa al 2% y la posición de las botellas con agua y solución de sacarosa se cambió diariamente durante los siguientes 5 días. Se midió el peso de los animales antes y después de la prueba, y se estimó diariamente el volumen de agua y solución de sacarosa. Se calculó la preferencia de sacarosa en % del líquido bebido durante la línea base y las pruebas [26,27,28].

Hyp13 se disolvió en solución salina. Los animales recibieron una inyección ip (vinj = 10 ml/kg) 20 minutos antes de cada prueba de comportamiento con 0, 1 o 5 mg/kg.

Se prepararon cortes horizontales de hipocampo (350 µm) a partir de ratones macho WT y TRPC6-KO anestesiados con sevoflurano (de 2 a 4 meses de edad) en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) helado que contenía una alta concentración de sacarosa (en mM): 75 sacarosa. , 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3 y 10 D-glucosa. Luego, las rebanadas se transfirieron a LCRa caliente (35 °C; 10 min) y posteriormente se mantuvieron a temperatura ambiente en LCRa con NaCl 125 mM, KCl 3 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 3 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO3 25 mM y NaHCO3 10 mM. D-glucosa. Los cortes individuales se transfirieron a una cámara de grabación sumergida (perfundida con LCRa normal que contenía CaCl2 2,5 mM y MgCl2 1,5 mM a 31 ± 1 °C) que se montó en la platina de un microscopio vertical. Todas las soluciones se gasearon con 95% O2/5% CO2 para mantener el pH alrededor de 7,4. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Protección Animal de Alemania y la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de noviembre de 1986/86/609/EEC, y con la aprobación del gobierno local.

Las células piramidales CA1 del hipocampo y las células granulares de la circunvolución dentada (DG) (en la lámina suprapiramidal) se visualizaron mediante contraste de gradiente Dodt y se registraron con pipetas de parche llenas con (en mM) 135 K-gluconato, 4 NaCl, 10 KCl, 5 Hepes. , 2 Na2-ATP y 0,3 Na3-GTP (pH 7,3), salvo que se indique lo contrario. Todos los potenciales se corrigieron según el potencial de unión líquida. Las propiedades pasivas de la membrana de las neuronas del hipocampo (p. ej., capacitancia, resistencia de entrada) se registraron a partir de la prueba de membrana poco después de pasar al modo de célula completa con un voltaje de membrana fijado a -70 mV. Para probar la excitabilidad neuronal en modo de sujeción de corriente, se utilizó un protocolo de rampa despolarizante con inyección de corriente de 0 a 100 pA en 2 s para provocar potenciales de acción (AP) en el potencial de membrana en reposo (RMP) y a -70 mV. Para explorar el mecanismo iónico de la respuesta provocada por la hiperforina, las células granulares se registraron en modo de fijación de voltaje (Vh de −70 mV) y se usó una rampa de voltaje que oscilaba entre −50 y −140 mV (en 1 s) para determinar la inversión. potencial. En algunos experimentos, el gluconato de K en la solución de la pipeta fue reemplazado por gluconato de Cs (CsGlu).

Los datos se recopilaron con un amplificador Multiclamp 700B junto con la interfaz Digidata 1440A y el software pClamp10.2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las señales se digitalizaron a 20 kHz y se filtraron a 6 kHz (pinza de corriente) o 2 kHz (pinza de tensión). Se utilizaron MiniDigi 1A y AxoScope 10.2 para la grabación de alcance de baja resolución, muestreada a 1 kHz. El análisis de datos se realizó fuera de línea con el software Clampfit 10.2 (Molecular Devices). Se utilizó OriginPro 2018G (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.) para estadísticas y cifras.

Se cultivaron células HepaRG (Biopredic International, Sant Grégoire, Francia) en medio William's E con glutamina 2 mM (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania) suplementada con 10% de FBS (FBS Good Forte aprobado por la UE; PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania). , 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Alemania), 0,05% de insulina humana (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania) y 50 µM de hemisuccinato de hidrocortisona (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) [ 41]. Las células se sembraron según las instrucciones del fabricante (placas de 96 pocillos: 9.000 células/pocillo, placas de 12 pocillos, 100.000 células/pocillo). Durante la proliferación, las células se mantuvieron durante 2 semanas en medio de cultivo. Posteriormente, las células se cultivaron durante dos semanas más para su diferenciación en el medio de cultivo descrito anteriormente, que contenía adicionalmente DMSO al 1,7%. 48 h antes de la incubación, las células HepaRG se adaptaron a un medio de tratamiento que contenía concentraciones más bajas de DMSO (0,5%) y FBS (2%). La concentración de DMSO debe reducirse para permitir que las células reduzcan su expresión de CYP. De lo contrario, no será visible ninguna inducción adicional de CYP.

Posteriormente, se realizó el tratamiento con los respectivos compuestos de prueba y controles diluidos en medio de tratamiento con una concentración final de DMSO del 0,5%. Se utilizaron células HepaRG para el análisis de la expresión génica. Debido a la escasa eficacia de transfección de las células HepaRG, se realizaron ensayos del gen informador en células HepG2.

Se cultivaron células HepG2 (ATCC, Middlesex, Reino Unido) en medio DMEM con alto contenido de glucosa (Pan-Biotech, Aidenbach, Alemania) suplementado con FBS al 10% (FBS Superior; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) y 100 U/ml de penicilina y 100 Estreptomicina µg/ml (Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Alemania). Las células se sembraron en una confluencia de aproximadamente 80 a 90% en placas de 96 pocillos para experimentos.

Los efectos citotóxicos de los compuestos de prueba se analizaron utilizando el reactivo de proliferación celular WST-1 (Sigma Aldrich, St. Louis, EE. UU.). Se sembraron células HepG2 en placas de 96 pocillos (20.000 células/pocillo) y se trataron con los compuestos de prueba 24 h después de la siembra. Se sembraron HepaRG en placas de 96 pocillos (9000 células/pocillo) y después de 28 días de diferenciación y 48 h de incubación previa, las células se adaptaron al medio de tratamiento, como se describió anteriormente y luego se incubaron con los compuestos de prueba durante 24 h.

Todos los compuestos de prueba y los controles se disuelven en medio de cultivo con una concentración final de disolvente de 0,5% de DMSO. Triton X-100 (0,01%) sirvió como control positivo. Una hora antes de que finalizara la incubación, se agregaron 10 µl de reactivo WTS-1 a cada pocillo que contenía 100 µl de medio y las placas se incubaron una hora más. Posteriormente, se midió la absorbancia a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 620 nm utilizando el lector de placas Tecan Infinite M200 Pro (grupo Tecan, Männedorf, Suiza). Los valores de la longitud de onda de referencia se restaron de los valores de absorbancia y los datos se corrigieron para la absorbancia de fondo restando los valores de los pocillos incubados sin células. Los datos se remitieron al control de disolvente, que se fijó en 100%. Se realizaron al menos tres réplicas biológicas independientes con tres réplicas técnicas por condición.

Se realizaron ensayos de indicador de luciferasa dual para medir la activación del receptor X de pregnano humano (PXR) mediante un ensayo de transactivación basado en GAL4, para el cual el LBD de PXR se había fusionado con el DBD de GAL4 (pGAL4-hPXR-LBD), junto con un reportero de luciferasa de luciérnaga impulsado por UAS que responde a GAL4 (pGAL4-(UAS)5-TK-LUC) [40]. La unión agonística de un compuesto de prueba al LBD de PXR conduce a la activación de la proteína de fusión, que se une a la UAS e inicia la transcripción del gen de la luciferasa de luciérnaga.

Además, las células siempre se transfectaron con un plásmido que expresaba constitutivamente el gen informador Renilla luciferasa (pcDNA3-Rluc) como control interno para la normalización. Las concentraciones de plásmidos y los controles positivos se enumeran en la Tabla 1.

Para realizar ensayos de indicador de luciferasa dual, se sembraron 20.000 células HepG2 en placas de 96 pocillos para el ensayo PXR. Las células se transfectaron transitoriamente 24 h después de la siembra utilizando TransIT-LT1 (Mirus Bio LCC, Madison, WI, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 4 a 6 h, las células se incubaron con compuestos de prueba o controles en medio de cultivo que contenía DMSO al 0,5%. Como controles positivos se utilizaron los conocidos agonistas de PXR SR12813 y Rifampicina. Después de 24 h de incubación, las células se lisaron con 50 µl de tampón de lisis (fosfato de potasio 100 mM con Triton X-100 al 0,2% (v/v), pH 7,8). Se investigaron cinco µL de lisado celular para determinar las actividades de luciferasa de luciérnaga y Renilla. La luminiscencia se midió con un lector de placas Infinite M200 Pro (grupo Tecan, Männedorf, Suiza). La señal de luciérnaga se normalizó con respecto a la señal de Renilla y se expresó en relación con el control de disolvente (que contenía DMSO al 0,5%). Se realizaron tres réplicas biológicas independientes con seis réplicas técnicas por condición.

Se sembraron células HepaRG en placas de 12 pocillos (100.000 células/pocillos) y se cultivaron como se describió anteriormente. Después de la diferenciación de las células seguida de 48 h de cultivo con medio de tratamiento, las células se incubaron durante 24 h con compuestos de prueba y rifampicina como control positivo. Las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se recogieron con 350 µl de tampón RLT (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Hilden Alemania) que contenía 3,5 µl de β-mercaptoetanol. El ARN total se extrajo siguiendo las instrucciones del fabricante con modificaciones menores [66]. La calidad y cantidad de ARN se midieron con un lector de placas Tecan Infinite M200 Pro (grupo Tecan, Männedorf, Suiza). La transcripción inversa de 0,5 µg de ARN se realizó con el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). La RT-PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando 20 ng de ADNc, la mezcla maestra Maxima SYBR Green/ROX qPCR (Thermofisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) y cebadores (5 µM; consulte la Tabla 2). El diseño del cebador se realizó utilizando la herramienta de software gratuita Primer3 (Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, EE. UU.). Los cebadores se diseñaron abarcando intrones y se verificaron para detectar errores de cebado, horquillas y dímeros utilizando NetPrimer (Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, EE. UU.) y la base de datos del conjunto (www.ensembl.org). Los cebadores se adquirieron en Eurofins Genomics Germany GmbH (Ebersberg, Alemania).

La expresión génica se midió con un ciclador de PCR en tiempo real Stratagene MX3005P (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los niveles de expresión del gen diana CYP3A4 se normalizaron con la media geométrica de los genes de referencia ACTB y GAPDH, que se expresaron de manera estable a lo largo de los tratamientos. Se utilizó ARN de tres réplicas biológicas independientes. La expresión genética relativa se calculó utilizando el método ΔΔCT. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes, los valores atípicos se identificaron mediante la prueba de Grubb y se excluyeron del análisis.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 7 o GraphPad Prism 8 (Graphpad Software, LaJolla, CA, EE. UU.). Los datos se muestran como media ± error estándar de las medias (SEM) o (SD). Para estudios conductuales y neuroquímicos en animales, se eligieron tamaños de muestra para obtener un tamaño del efecto de Cohen d > 0,5 con α = 5% y una potencia de 0,8. El tamaño amplio para estudios con animales fue determinado por la experiencia previa con esos paradigmas de prueba y los valores medios y la varianza derivados de los mismos. Esto se incorporó a un análisis de G-Power para la lectura principal de cada paradigma. La distribución de los datos se verificó con la prueba general de normalidad de D'Agostino Pearson. Se utilizó la prueba t de Student no apareada o la prueba de Mann-Whitney si los experimentos constaban de dos conjuntos de datos. Para considerar dos parámetros diferentes se utilizó ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Sidak. Se consideró estadísticamente significativo p ≤ 0,05.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente.

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Este artículo está dedicado al fallecido Prof. Dr. Christian Harteneck, quien falleció demasiado pronto. Fue un colega y colaborador inspirador durante muchos años, que también inició este estudio y a quien extrañamos mucho. Agradecemos a Daniel Thon, Joscha Berger, Anja Koellner, Bea Rosskopp, Doreen Stern y Benedikt Quinger por su excelente asistencia técnica. La hiperforina Na+ fue proporcionada generosamente por el Dr. Willmar Schwabe GmbH, Karlsruhe, Alemania. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC 2051 - ID de proyecto 390713860 y subvenciones de investigación 270949263/ GRK 2162, AL 294/10-2, MU2789/7-2, MU 2789 /8-2, NU 53/12-2 y EraNet (Consorcio HypZiTrp). Además, contaron con el apoyo de la Fundación Carl-Zeiss, el Centro de Resonancia Magnética Biomolecular (BMRZ) de la Universidad Goethe de Frankfurt, financiado por el estado federado de Hesse, y el LOEWE Main Research Focus DynaMem, financiado por el estado federado de Hesse en el marco del Iniciativa de Hesse para la excelencia científica y económica (LOEWE) (a la UAH).

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Los siguientes autores contribuyeron igualmente: Yamina El Hamdaoui, Fang Zheng.

Farmacología y Toxicología, Instituto de Ciencias Farmacéuticas y Biomédicas, Johannes-Gutenberg Universität Mainz (JGU), Mainz, Alemania

Yamina El Hamdaoui, Nicholas Fritz, Lian Ye, Kevin Schwickert, Tanja Schirmeister y Kristina Friedland

Instituto de Fisiología y Fisiopatología, Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg (FAU), Erlangen, Alemania

Fang Zheng y Christian Alzheimer

Instituto de Química Orgánica y Química Macromolecular, Facultad de Química y Ciencias de la Tierra, Universidad Friedrich Schiller Jena, Jena, Alemania

Mai Anh Tran y Ute A. Hellmich

Bioquímica, Departamento de Química, Johannes-Gutenberg Universität Mainz, Mainz, Alemania

Mai Anh Tran y Ute A. Hellmich

Departamento de Seguridad Alimentaria, Instituto Federal Alemán para la Evaluación de Riesgos, Max-Dohrn-Str. 8-10, 10589, Berlín, Alemania

Albert Braeuning y Dajana Lichtenstein

Clúster de Excelencia “Balance of the Microverse”, Friedrich-Schiller-Uniersität Jena, Jena, Alemania

Ute A. Hellmich

Centro de Resonancia Magnética Biomolecular, Universidad Goethe, Frankfurt, Alemania

Ute A. Hellmich

Departamento de Química y Farmacia, Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg (FAU), Erlangen, Alemania

Dorothee Weikert y Markus Heinrich

Departamento de Psiquiatría y Psicoterapia, Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia, Maguncia, Alemania

Giulia Treccani

Instituto de Anatomía, Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia, Maguncia, Alemania

Giulia Treccani

Departamento de Anestesiología, Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia, Langenbeckstr. 1 (Bld. 505), 55131, Maguncia, Alemania

Michael KE Schäfer

Departamento de Farmacobiología, Facultad de Medicina de la Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia

Gabriel Nowak

Departamento de Farmacología, Terapia Experimental y Toxicología, Universidad Eberhard-Karls de Tübingen, Tübingen, Alemania

Bernd Núremberg

Departamento de Psiquiatría y Psicoterapia, Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg (FAU), Erlangen, Alemania

Christian P. Müller

Centro de Investigación de Medicamentos, Universiti Sains Malaysia, 11800, Minden, Penang, Malasia

Christian P. Müller

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KF, CA y CPM iniciaron el estudio, diseñaron experimentos, supervisaron la investigación y escribieron el manuscrito. AB, DL, MKES, GN, BN, UAH y MH supervisaron la investigación. YE, LY, MAT, NF, GT, KS, TS, UAH y DW realizaron los estudios químicos, de imágenes de calcio, electrofisiológicos y bioquímicos. FZ y CA realizaron estudios electrofisiológicos en cortes de hipocampo. CPM realizó estudios de comportamiento. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Christian P. Müller o Kristina Friedland.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

El Hamdaoui, Y., Zheng, F., Fritz, N. et al. El análisis de la acción de la hiperforina (hierba de San Juan) en el canal TRPC6 conduce al desarrollo de una nueva clase de fármacos antidepresivos. Mol Psiquiatría 27, 5070–5085 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01804-3

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Recibido: 25 de noviembre de 2021

Revisado: 02 de septiembre de 2022

Aceptado: 14 de septiembre de 2022

Publicado: 12 de octubre de 2022

Fecha de emisión: diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01804-3

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